质粒DNA的提取与鉴定

质粒DNA的提取、定量及电泳鉴定实验内容提取原理操作步骤计算方法操作步骤质粒DNA定量电泳原理电泳步骤电泳酶切原理酶切步骤酶切电泳原理电泳步骤电泳实验二实验四1.单克隆挑取2.质粒DNA提取原理3.质粒DNA操作步骤4.紫外检测定量知识5.酶切原理、操作步骤6.琼脂糖电泳原理及步骤7.凝胶成像系统质粒DNA的提取酶切分析质粒定量琼脂糖凝胶电泳实验流程实验四实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作第二部分质粒DNA提取与定量ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA•独立于细菌染色替外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；•存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多．质粒（Ｐlasmid）定义碱裂解法煮沸裂解羟基磷灰石柱层析法质粒DNA释放法酸酚法等方法•选择哪一种方法主要取决以下几个因素：质粒的大小大肠杆菌菌株裂解后用于纯化的技术和实验要求分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：•培养细菌使质粒扩增；•收集和裂解细菌；•分离质粒DNA分离质粒DNA三步曲分离质粒收集裂解细菌质粒扩增基本步骤基本原理1、碱裂解法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，形成沉淀通过离心除去；2、离心层析柱基本原理硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；☆原理示意图（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pET21质粒的大肠杆菌DH5α（三）试剂：LB培养基（液体）、氨苄青霉素质粒提取试剂盒（天根，中国）•平衡液BL•溶液P1•溶液P2•溶液P3•去蛋白液PE•漂洗液WB•洗脱液EB仪器材料•50mmol/L葡萄糖•25mmol/LTris·Cl(pH8.0)•10mmol/LEDTA(pH8.0)作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块溶液I•0.2mol/LNaOH•1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次新鲜配制使用溶液II•5mol/L乙酸钾60ml•冰乙酸11.5ml•水28.5ml作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，Na＋可中和DNA注意：复性时间不宜过长溶液III菌液700μl×2离心13000rpm,1min弃上清瞬时离心彻底弃上清加250μl溶液P1旋涡振荡悬浮沉淀加250μl溶液P2加350μl溶液P3颠倒数次放置3-5min离心13000rpm,10min取上清700μl加到吸附柱中离心13000rpm,1min（1）重复收菌一次（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）弃滤液，加入500μl漂洗液WB（10）离心13000rpm,1min弃滤液，加入500μl漂洗液WB（11）离心13000rpm,1min弃滤液（12）空柱离心13000rpm,2min放入一个干净的离心管中(开盖放置3min)，在吸附膜的中间加30μl洗脱液EB(放置1min)离心13000rpm,1min（13）-20℃保存备用操作步骤颠倒数次加入500μl平衡液到吸附柱中离心13000rpm,1min（9）为增大提取产量，步骤13可重复一次紫外光吸收法原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2,而且物质对光的吸收是具有选择性的3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.定量检测•计算方法:因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。dsDNA(双链DNA)1A260=50ug/mlssDNA(单链DNA)1A260=33ug/mlRNA1A260=40ug/ml定量检测记录A260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:质粒DNA(g/ml)=50×(A260)×稀释倍数注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值.定量检测根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280）•Ratio=1.8DNA样品较纯,符合实验要求•Ratio＞1.9RNA污染•Ratio＜1.6蛋白质或其它杂质的污染定量检测•实验仪器定量检测紫外分光光度计比色杯数据处理测量次数质粒DNA浓度(μg/mL)Ratio值(A260/A280)123平均值定量检测定量检测1.菌体老化2.碱裂解不充分3.菌体中无质粒4.溶液使用不当1.请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养2.可减少菌体用量或增加溶液的用量3.不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。4.溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？原因对策常见问题1.混有蛋白2.混有RNA3.混有基因组DNA1.不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.加入RNaseA室温放置一段时间3.加入溶液II和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。问题二：质粒纯度不高，如何解决？原因对策常见问题第二部分琼脂糖凝胶电泳DNAAgaroseGelElectrophoresis天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。定义琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).实验原理1、DNA的分子大小2、琼脂糖浓度3、DNA分子的构象4、电源电压5、嵌入染料的存在6、离子强度影响影响迁移速率因素分离范围１.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。２．Gelview３．TBE４．琼脂糖5、DNAMarker5000实验材料溴化乙锭(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性.Gelview:是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高,且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光.常用染料实验材料是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。DNAMarker应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。实验材料电泳缓冲液4℃保存备用实验材料凝胶准备胶床准备铺胶静置胶床置于电泳槽中加电泳缓冲液拔梳子上样电泳取出凝胶拍照实验步骤•倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使制板变形•胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔•电泳前，确认样品孔位于电场负极；•点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多•Goodview切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔•紫外线照射不要太久注意事项质粒抽提电泳图谱解析123456789101112M131415161718192021222324123456789101112M1314151617181920212223242000bp1000bp750bp500bp250bp100bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp质粒DNA鉴定：多数情况下会出现三条带，分别为超螺旋，开环及复制中间体过度振荡，大肠杆菌的基因组片段（20-100kb）开环复制中间体超螺旋基因组片段蛋白质残余质粒蛋白残余基因组DNA23srRNA5srRNA16srRNA无RNase消化的质粒DNA电泳图谱分析123456789101112131415M161718192021222324原因分析：1.起始菌液太少，质粒溶解用水太多，导致质粒浓度太低，低于5ng/µL2.部分可能是由于操作失误：移液器使用不准确，所加溶液没有按照所需的比例加入，导致质粒抽提失败。3.目前已经抽提的质粒有明显的拖尾，原因可能是电泳效果不好造成的。第四部分酶切鉴定DNARestrictionEnzymeDigestion限制性内切酶（restrictionendonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶限制酶的切割点因酶而异，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段,如HaeIII,有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ.限制性内切酶★平末端在识别顺序的中心对称轴处切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G5’HaeIII限制性内切酶★3’端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。5’G-G-T-A-C-C3’3’C-C-A-T-G-G5’G-G-T-A-C3’CC3’C-A-T-G-GKpnI限制性内切酶5’G-A-A-T-T-C3’3’C-T-T-A-A-G5’GC-T-T-A-A5’5’A-A-T-T-CGEcoRI★5’端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。5’A-A-G-C-T-T3’3’T-T-C-G-A-A5’AT-T-C-G-A5’5’A-G-C-T-TAHindIII限制性内切酶双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；限制性内切酶Buffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20ul。以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外该酶可分解15μg的DNA。限制性内切酶插入400bpDNA片段质粒大小为:5442bp+400bp=5842bp切下的片