药敏试验简介

药敏试验简介卢先雷本节课程需要掌握的内容•什么是药敏试验，什么时候需要做药敏试验——即药敏试验的临床指征是什么？•药敏试验方法学——怎么做•药敏试验结果的正确判读与解释——怎么观察•药敏结果的正确报告•药敏试验的室内质量控制药敏试验的概念与适应征•通过模拟体内环境条件，测试分离自病人体内感染部位的病原菌对常用抗生素的敏感性，即抗生素对目标细菌的抑制能力，从而预测抗生素治疗效果的一种体外试验方法。•药敏试验适应征：分离菌是感染菌而不是定植菌或污染菌；常规经验治疗效果不佳或有较高失败风险时；对感染菌的耐药性无法估计时；需要了解微生物耐药性变迁时药敏试验方法学•纸片扩散法•稀释法（MIC法）–肉汤稀释法•常量稀释法•微量稀释法–琼脂稀释法•E-test法药敏试验方法学指南•美国CLSI–M2-A10DiskDiffusion(2009)*–M7-A8MIC(2009)*–M11-A7Anaerobes(2007)–M24-AMycobacteria,Nocardiae,andOtherAerobicActinomycetes–M27-A2FungalMIC(2002)–M44-AFungaDiskDiffusion(2004)–M45-AInfrequentlyIsolated/FastidiousBacteria(2006)*M2,M7updatedevery3years•其他标准：–法国CASFM标准；梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准–英国BSAC标准；欧洲应用比较广泛的标准–德国DIN标准……..纸片扩散法•原理–一定药物含量的碟形抗生素纸片贴在涂布一定浓度菌液的琼脂上，过夜培养后抗生素扩散到纸片周围的琼脂中，形成一定浓度区域，越靠近纸片的浓度越高，反之越低；–当低到一定程度（MIC以下）时药物无法抑制细菌的生长，从而形成界限分明的抑菌环–通过抑菌环大小与MIC值高低之间的统计学分布关系，经过回归处理可以求出细菌对某种抗生素的MIC折点范围对应的抑菌环大小值。由此可知，MIC与抑菌环大小之间存在负相关，。试验方法与条件•CLSI推荐培养基：–普通营养要求细菌使用水解酪蛋白琼脂（MHA）平板–肺链使用含5%绵羊血的含血MHA–嗜血杆菌使用HTM培养基–淋球菌使用含1%生长因子（不含L-半胱氨酸）补充剂的GC培养基•平皿大小：最小90mm，通常使用150mm平板•琼脂厚度4±1mm•菌液浓度0.5McF（约1.5×108CFU/ml）•涂布方法：无菌棉签浸透菌液后稍微挤干，棉签与平板呈30°左右的倾角密集左右来回涂布，完成一遍后旋转120°后再涂，如此三次，最后绕边缘一次•纸片之间最佳间距30mm，不得低于25mm•培养温度；35℃；重叠时不超过3个碟子•气体环境：普通细菌大气环境；嗜血杆菌、淋球菌、肺链置CO2环境•培养时间：18小时测量方法•透射光−葡萄球菌利奈唑胺苯唑西林万古霉素−肠球菌万古霉素•反射光–测量其他细菌与药物时•变形杆菌•忽略环内的迁徙生长•测量肉眼可见的明显抑菌区•忽略环边缘的微弱生长环内生长现象大肠药敏，被肠球菌污染铜绿假单胞菌耐药亚群特殊处理方法•当受测抑菌环与旁边的融合时，选择完整部分测量•当受测抑菌环部分变形时，选择正常部分测量扩散法药敏影响因素•培养基–pH值7.2-7.4–营养程度（肠球菌能生长）–厚度–抗生素拮抗剂含量（用29212监控）–钙镁离子含量、锌离子含量（用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控）•菌悬液–浓度高抑菌环缩小–浓度低则扩大•细菌纯度•气体环境–普通细菌放CO2时由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药–苛养菌放普通环境生长不良，导致假敏感•培养时间–粘液性铜绿需48小时•测量方法稀释法（MIC法）•MIC法：分为常量法和微量法常量法：肉汤稀释法、琼脂稀释法微量法：微量肉汤稀释法简化双浓度折点法ATB药敏简化常规浓度分布MIC法BD、德灵药敏动力学计算MIC法VITEK32、VITEK2药敏试验方法与条件•CLSI推荐培养基：–普通营养要求细菌使用补充阳离子MH肉汤–肺链使用含2%冻融马血的MH肉汤–嗜血杆菌使用HTM肉汤–厌氧菌和微需氧菌使用布氏肉汤–淋病奈瑟菌推荐强化GC作琼脂稀释法•菌液浓度（5×104CFU/ml）：–初始菌液0.5McF（约1.5×108CFU/ml）盐水稀释200倍，加入0.1ml菌液到含有0.1ml双倍浓缩的MH肉汤的微孔板中（或预先用标准浓度的MH肉汤稀释后再加到微孔中）•接种后应充分混匀，但不能有气泡产生•静置培养•培养温度；35℃•气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2•培养时间：18小时•结果读取：–见后面的幻灯：常量稀释法•药敏试验的参考方法：将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中.过夜培养.MIC即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡到50℃的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，浓度也为104CFU/ml).解释标准(SorR)是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上104cfu/ml4210.50.250.120mg/ml微量肉汤稀释法商品化药敏系统MicroScanSensititrePhoenixVitek2compact微量肉汤稀释法结果读取技巧•磺胺类药物容易出现弱生长，只要满足70%以上抑菌率即可视为未生长•真菌药敏三唑类药物容易出现拖尾现象（即低浓度孔易出现弱生长），判读时以对照孔为参照，＞80%的抑菌率即可视为未生长•大于三孔不同梯度浓度的抗生素测试中，出现的高浓度生长，而低浓度不生长现象叫跳孔。造成跳孔的主要原因，菌悬液乳化不充分，细菌分散不足，以及药敏卡某些孔被污染•跳孔的解决方法：根据其他药理学特征类似的抗生素的敏感性以及分析其他同类不同种抗生素的敏感性进行推断性修正–修正低浓度——耐药–修正高浓度——敏感肉汤稀释法注意事项•生长缓慢微生物（形成肉眼可见生长＞1周）不适合用MIC法•在肉汤中发育不良的微生物不适合用MIC–粘液性铜绿假单胞菌——只能用扩散法，48小时观察结果–淋病奈瑟菌——CLSI无肉汤稀释法药敏指南•注意微弱生长导致的假敏感（结果需要修正）–例如铜绿对磺胺、四环素、头孢噻肟/曲松–鲍曼不动杆菌对氨曲南–肺克、阴沟、变形杆菌对呋喃妥因稀释法药敏影响因素•培养基–pH值7.2-7.4–营养程度–抗生素拮抗剂含量–钙镁离子含量（钙10-25；镁10-12.5μg/ml）•菌悬液（5×104CFU/ml）–接种效应•浓度高MIC抬高•浓度低MIC压低•细菌纯度•气体环境–所有需氧细菌均放普通大气环境。如果放CO2，由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药•培养时间–真菌需48小时–奴卡菌需5天MIC值标注于试条的光面Etest试条毛面贴于MHA上Etest操作程序按照扩散法标准操作涂布接种贴上试条并培养15-18小时读取抑菌浓度并按标准解释肺炎链球菌青霉素MIC=3mg/ml结果读取药敏解释标准•CLSI标准；全球性每年更新非强制性学术机构•FDA标准（全球标准）建立在CLSI基础上6~8年更新一次官方机构，标准带有强制性•法国CASFM标准；梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准•英国BSAC标准；欧洲应用比较广泛的标准•德国DIN标准……..CLSI药敏解释标准•CLSI(ClinicalLaboratorystandardinstitution)药敏指南CLSI药敏文件•M100-S22常见菌(2012)**•M11-A7厌氧菌(2007)•M39-A3积累抗菌谱(2009)•M24-A分枝杆菌,奴卡菌,以及其他需氧放线菌•M27-A2酵母样真菌MIC法(2002)•M44-A真菌纸片扩散法(2004)•M45-A低频分离菌与苛养菌(2006)*M100updatedyearlyM2(纸片法操作方法)M7(MIC法操作方法)M100（解释标准）•作为共识标准即“参考方法”•临床实验室通常这样使用–使用CLSI方法记录–采用其他方法时使用CLSI做参照方法进行比对更新信息M2表格扩散法M7表格MIC法附录词汇表I&II&IIICLSIM100“表格”内容•抗生素的测试与报告•SIR折点•质控M100•抗生素的测试与报告•SIR折点•质控CLSIM100-S22更新信息CLSIM100-S22GlossaryI(Part1)CLSIM100-S22词汇表IPart1,例如抗生素类别抗生素亚类含盖的抗生素;通用名青霉素类青霉素亚类青霉素青霉素酶稳定青霉素氯唑西林双氯西林甲氧西林萘夫西林苯唑西林CLSIM100-S22词汇表II例如抗生素类别抗生素缩写给药途径药物类别口服静脉滴注肌肉注射阿米卡星AN,AK,Ak,AMI,AMKXX氨基糖苷类氨苄西林AM,Am,AMPXXX青霉素类我们应该如何测试和报告?CLSIM100-S22.Table1A点击放大分组测试与选择性报告•在做药敏时每组中不同类药物只选用一种抗生素用于测试，药理作用特殊者单独测试，这些抗生素称为代表药物。•按CLSI规定，由FDA根据抗生素在临床实践中表现出来的安全性、有效性、和医学经济学原则将抗生素分为A,B,C三组。报告时按照A→B→C的次序进行报告。关于抗生素分组A组药物是首选药物，属于最经济有效，最安全的抗生素类别B组是在A组药物无效时，或者感染不单纯需要扩展微生物覆盖范围时选用的药物，耐药性一般较A组药物低，但可能价格较贵或者安全性处于考察期内C组药物是A组和B组药物都耐药时需要选用的备用抗生素，通常用于治疗高耐药菌株和严重的复杂性感染。耐药性最低，但价格昂贵或者安全性差•适合于治疗尿路感染的抗生素被归入U组•可考虑选择性应用但其适应症或适用范围不属于常规报告范畴的抗生素归入O组•处于考察过程中的某些新药和某些老药在扩展应用范围时归入Inv组关于代表药物•微生物室选取用于测试和报告的抗生素是可以代表一类抗菌原理相同，抗菌效能相仿，抗菌谱基本一致，并且耐药机制相同的药物。即只需测试一种药物就可以推测出该类药物中其他几种药物的敏感性。•在根据药敏结果选用抗生素时只需选用效果相同的即可。关于代表药物•需要注意：–代表药物的代表作用只能针对同一类别的微生物，即位于表1A中同一框内的几个药物选取其中一个即可代表该类(或亚类)药物–如果一类中有几个药物分别位于不同框中，则说明这几个药物抗菌活性或耐药谱有所不同，需要分别测试我们如何理解“选择性报告”?•首先报告窄谱,低毒性,最便宜的药物•如果有下列情况，则报告其他药物:–对一线药物耐药时(A组药物)–分离菌来自特殊部位–病人对一线药物过敏或不耐受–多种微生物感染混合感染–不同微生物导致的多部位感染铜绿假单胞菌头孢他啶8S环丙沙星1S庆大霉素2S哌拉西林/他唑巴坦16SMIC(µg/ml)选择性报告例如选择性报告GroupBGroupB阿米卡星8S头孢他啶32R环丙沙星1S庆大霉素16R亚胺配能4S哌拉西林/他唑巴坦128R妥布霉素16RMIC(µg/ml)选择性报告选择性报告例如铜绿假单胞菌GroupBGroupBGroupB我们应该使用分级报告规则吗?•是,这个规则是经过国际医疗组织众多医务工作者一致通过的•是,这将有助于临床医生在开处方时，将范围集中于:–窄谱抗生素–低毒抗生素–廉价抗生素•也许不是——如果在我们所在的医疗机构中我们能有更好的办法激励临床医生“谨慎处方”的话粘质沙雷菌氨苄西林R头孢唑林R头孢曲松S庆大霉素S亚胺配能R哌拉西林/他唑巴坦S复方新诺明S报告偶然发现的亚胺配能耐药现象(通常情况下，一般实验室在哌拉西林和头孢曲松测定敏感时，不会报告亚胺配能的结果（多数情况下该药是敏感的），但需要注意如果测定出耐药时，就必须报告)例如：金属酶？修正为R修正为RCLSIM100表1的解读注意：•“方框”的含义•“或”字