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RNA的分离纯化技术第四组3/8/2020【实验目的】1.了解RNA分子的种类、分布及其结构特点2.掌握总RNA提取的基本原理和实验方法3.掌握总RNA浓度检测的方法4.掌握总RNA完整性检测的方法3/8/2020主要内容•RNA的概述•分离RNA的意义•总RNA的分离与纯化•结果分析3/8/2020RNA（RibonucleicAcid)的概述存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名，简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子；也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA3/8/2020RNA的分类•信使RNA（messengerRNA，mRNA）mRNA是合成蛋白质的模板，按照细胞核中的DNA所转录；•转移RNA（transferRNA，tRNA）tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；•核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。•微小RNA（microRNA，miRNA）内源性的具有调控功能的非编码RNA3/8/2020分离RNA的意义进行完整的RNA的提取和纯化是进行RNA方面研究工作的基本前提，如Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、基因表达水平检测、cDNA合成及体外转录和翻译等实验均需要首先得到高质量的RNA样品。3/8/2020总RNA的分离1、异硫氰酸胍—酚法异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库。3/8/2020异硫氰酸胍—酚法提取植物组织总RNA1）取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4－5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。2）置于冰上，顺序加入：50μl2mol/LNaAc,混匀，0.5mL水饱和酚，170μlCI，混匀。置冰上15min。3）各管平衡后，4℃,12000g离心20-30min。转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。4）用70％乙醇洗一次，4℃，12000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150μl异硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。3/8/20205）加等体积异丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。6）用70％乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPC－H2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于－80℃冰箱中存放。7）紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析完整性。3/8/20202、TRIzol法•TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。3/8/2020试验流程图细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)细胞选择贴壁细胞悬浮细胞3/8/20203、苯酚法•细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。•苯酚法提取酵母RNA3/8/20204、密度梯度离心•用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度1.33g/cm3在最上层。DNA密度在1.71g/cm3左右，位于中间。RNA密度1.89g/cm3,沉在底部。用此方法可制备较大量纯度的天然RNA3/8/2020结果分析•分光光度法测260nm和280nm下OD值•Northern-Bolt杂交•1）甲醛-琼脂糖凝胶电泳•2）聚丙烯酰胺凝胶电泳•RT-PCR检测3/8/2020RNA制备的条件与环境•为防止RNase对RNA的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。3/8/2020