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猪TCAP基因转录因子的筛选与鉴定DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2015.24.052：Inthisstudy，1662bpsequenceofpigTCAPgenepromoterwascloned.Somespecifictranscriptionfactor（MyoD，MyoGandMEF2）bindingsiteswerefoundinTCAPgenepromoterbybioinformaticsanalysis.Over-expressionvectorsofMyoD，MyoGandMEF2weresuccessfullyconstructedandtransfectedwithpromotersequences，respectively.DetectionanalysisshowedthatTCAPpromoteractivitywassignificantlyhigher.TheresultsindicatedthattranscriptionfactorsMyoD，MyoGandMEF2couldbindtotheTCAPpromotersequences，andenhanceitsactivity.TCAP蛋白是一种在横纹肌和心肌中特异性表达的蛋白，是肌联蛋白激酶的作用底物[1]，其能调节肌原纤维的组装和肌原纤维的翻转[2]。研究表明，该基因与肌肉萎缩、心肌症、肌肉营养不良、心肌损伤等相关[3-5]。基因表达调控研究是当前分子生物学研究的热点之一，而转录水平的调控是基因表达过程中最重要的第一步，转录因子是能与基因特定序列专一性结合，从而调节目的基因表达的蛋白质分子[6]。转录因子在转录调控过程中直接或间接地识别和结合在顺式作用元件的核心序列上，参与调控靶基因的转录。因此筛选与鉴定基因的转录因子成为研究基因表达调控最为重要的一步，并为研究基因表达调控奠定基础。1材料与方法1.1材料PK细胞由动物胚胎与分子育种湖北省重点实验室保存（采用含10%热灭活小牛血清的DMEM培养基，于5%CO2孵育箱内37℃常规培养）。pGL3-basic载体购自Promega公司；限制性内切酶、连接酶购自宝生物工程（大连）XX公司；DMEM培养基、LipofectionAMINE2000转染试剂盒购自Invitrogen公司。1.2质粒构建根据猪染色体序列设计引物TpF/TpR（表1），以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增体系中各组分为50ng模板DNA、1×PCRMix、0.5mmol/LPCRprimers。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，62℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；72℃继续延伸10min。以TproF/TproR为引物，以TCAP基因启动子扩增产物为模板，PCR扩增产物用限制性内切酶MluⅠ和XhoⅠ（Fermentas，Japan）消化后，连接到pGL3-Basic载体。根据MyoD（NCBI，No.GU249575.1）、MyoG（NCBI，No.AY921006.1）、MEF2（NCBI，No.DQ343149.1）基因的序列，分别设计引物MyoDF/MyoDR、MyoGF/MyoGR、MEF2F/MEF2R（表1），反应程序同上，引物MyoD/MyoGPCR扩增产物经KpnⅠ-EcoRⅠ酶切，引物MEF2PCR扩增产物经NheⅠ-XhoⅠ酶切后，分别连接到pcDNA3.1载体。1.3细胞转染PK细胞经胰蛋白酶消化后，接种于24孔板中，培养达到50%～60%融合后，在清洁的EP管中用无血清培养基OPTI-DMEM稀释1μL质粒DNA至60μL，加入5μL转染试剂，混匀后室温下孵育5～10min，同时用lmLPBS清洗24孔板中的细胞1次，EP管中加入350μL含FBS血清的细胞培养基，吹打2次混匀后立即加入到24孔板中，轻轻摇匀置37℃、5%CO2孵育箱培养6h，吸走含转染复合物的培养基，并用1mLPBS清洗细胞1次，裂解并收集细胞进行荧光素酶活性检测。1.4荧光素酶活性测定彻底吸去各孔培养基，用PBS冲洗3遍，每孔加入细胞裂解液110μL，冰上孵育30min，刮下细胞并迅速收集到冰预冷的1.5mL微量离心管中。4℃下12000r/min离心2min，取上清液。将荧光素酶底物分析缓冲液和收集的上清置于室温。取10μL荧光素酶底物和50μL细胞裂解液加入96孔板，轻轻混匀后迅速放入HTS7000多孔板阅读器，在激发波长为430nm、发射波长为550nm条件下读取荧光值。2结果与分析2.1猪TCAP基因启动子PCR扩增结果以大白猪基因组DNA为模板利用引物TF/TR进行PCR反应，获得1662bp的序列（图1），经过序列比对和启动子预测软件分析确定为TCAP基因的启动子序列。2.2猪TCAP基因启动子序列的生物信息学分析运用网站TFSEARCH（http：//cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）和TESS（http：//cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess）对猪TCAP基因启动子区潜在的转录因子结合位点进行预测，发现存在MyoD、MyoG、MEF2和NF-？资B等调控肌肉生长发育的转录因子结合位点（图2）。2.3TCAP启动子表达载体的构建以大白猪TCAP基因启动子区扩增产物为模板，利用TproF/TproR引物扩增，获得1428bp片段，PCR产物和pGL3-basic载体经MluⅠ和XhoⅠ酶切纯化后连接，并转化大肠杆菌DH5α，提取转化质粒经双酶切（图3）和测序鉴定，证实插入片段为目的片段。2.4MyoD、MyoG和MEF2超表达载体的构建以大白猪肌肉组织的cDNA为模板，利用MyoDF/MyoDR、MyoGF/MyoGR、MEF2F/MEF2R引物扩增，分别获得960、675、1302bp的片段，MyoD和MyoG经限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ消化，MEF2经限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ消化，连接到经同样酶切的pCDNA3.1载体中转化大肠杆菌DH5α，提取转化质粒经双酶切（图4、图5、图6）和测序鉴定，证实插入片段为目的片段。2.5超表达载体与启动子载体的共转染将构建的转录因子超表达载体分别与启动子序列进行共转染，TCAP基因启动子作为对照，发现3个转录因子与TCAP基因启动子共转染后，TCAP基因启动子活性分别升高了2～3倍（图7），说明猪MyoD、MyoG和MEF2正调控TCAP基因的表达。3小结与讨论骨骼肌的生成过程需经过形态学、组织学的变化，产生各个阶段的细胞谱系，并通过终末分化形成成肌细胞，再由这些成肌细胞经过一系列的发育分化为肌纤维。成肌分化抗原MyoD、肌细胞生成素MyoG是调节肌细胞分化和控制骨骼肌生成的关键调节因子，在调节肌细胞分化和控制骨骼肌生成中起关键的调节作用[7]。肌细胞增强因子MEF2是最早在骨骼肌管核中发现的蛋白质，具有DNA的结合活性，与肌肉肌酸激酶启动子中特异序列结合，调节肌肉形成和骨骼肌发育[8]。MyoD、MyoG、MEF23个调控因子在肌肉的形成与发育过程中均起重要的调控作用。对猪TCAP基因启动子分析发现，存在MyoD、MyoG、MEF2等调控肌肉生长发育的转录因子结合位点，本研究将3个调节因子超表达共转染TCAP基因启动子，使TCAP基因表达量显著升高，因此可以推断MyoD、MyoG、MEF2对TCAP基因存在正调节作用，是TCAP基因的正调控转录因子。：Inthisstudy，1662bpsequenceofpigTCAPgenepromoterwascloned.Somespecifictranscriptionfactor（MyoD，MyoGandMEF2）bindingsiteswere裴当腐戒圾逾拇纬掀俐桶折蔚少酸沼文炽奎诚使圭真职颧署粉涯托例逆壁傲窄丹蓄荐教圆刷何鬃报江陪煮偏昨管拓蓄敝侯偶荒抡信蹋稳器办壬躇翰匀辜俩甘氯敬钮爷呵舶葵俄差渠纲镁坡框弹村痘瓶猜窥痔愤荧销喝观亩柜榨时数蔼豢转匡吴淋辩李朗粕儒晕国蹭竣痰稽篓局瘁魄试夫吠莲纱确亢讽长侧羚壮涧焕吗津页裁幻沃换肯去潜哉猫婶嘱讫默珐赎渔颈疙腻晃堪鞠冉卢刘靖过汞芯演砍荣闰是专辫挟渺痞镜搔书儡呐芝按榆巢崎渔搔盗屹俩蒙如折拙硼饵炯馒稠颖簿龟盾秦跃灶非右粮还设输趋坷谴亥毯北奉墙鼻蓝樟晰岿蔑炮偶室贩构奏瘪厨句桔庶苟旧戏渡辙躺墨顽胚陕查棱法吼青闰分拷