生物指示菌片无菌检验规范

技术文件生物指示菌片无菌检验规范文件编号版号页次发布日期1目的规定灭菌工序质量监测点的检验方法，有效的控制该工序质量。2范围本方法适用于灭菌工序生物指示菌片的无菌检验。3检验方法3.1原理将枯草杆菌黑色变种芽胞菌片（Atcc9372以下简称“菌片”）置培养基内，在一定的温度下培养，观察细菌是否生长。3.2培养基制备3.2.1在配制培养基前，先配少量培养基观察其灭菌后是否有浑浊，长菌情况是否良好，合格后方可大量配制。在更换厂牌号时应重试。3.2.2制备各种培养基时，可用2mol/L盐酸或2mol/L氢氧化钠溶液适量调节PH值，使灭菌后的PH值在规定范围内。3.2.3营养肉汤的配制：按瓶装上的说明书要求配制，溶解，搅拌均匀，每支试管分装15-20培养基，灭菌.3.2.4在使用前，培养基须经35℃±2℃培养48h。3.2.5制备好的培养基应保存在2℃～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。3.3仪器与设备超净工作台、高压蒸气灭菌器、9cm直径双碟、镊子、剪刀。3.4试验前准备3.4.1器具灭菌与供试液接触的所有器具应采用可靠的方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30mim，或置电热干燥箱内160℃2h。3.4.2无菌室要求无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。a)无菌室内除定期用甲醛加高锰酸钾（或甲醛蒸汽）消毒外，每次操作前用75%洒精或消毒溶液擦试工作台面及一些可能污染的死角。用紫外灯杀菌至少30min。在每次操作完毕后，同样用上述液体擦试工作面。技术文件生物指示菌片无菌检验规范文件编号版号页次发布日期b)无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取内径90mm双碟，无菌操作注入融化的大豆酪蛋白琼脂培养基20ml，制成平板，先在30℃～35℃培养48h证明无菌后，取双碟平板3只，在无菌室操作台内平均放置，打开碟盖，暴露30mim后盖好，置30℃～35℃培养48h后取出检查，3只双碟上生长的菌落数平均不得超过1个。c)无菌试验过程中也需要检查无菌室的菌落数，方法同上。在试验开始进行时，打开碟盖，至试验结束盖好，照上法培养，应符合上述要求。3.5试验方法按无菌操作法，每一灭菌柜将已灭菌的菌片（枯草杆菌黑色变咱芽胞Atcc9372，含菌量2.4×106）分别接种于营养肉汤培养基（1个菌片/管），另取2管营养肉汤培养基，1管接种1个未灭菌的菌片，供作阳性对照，另1管作为阴性对照。接种后，上述接种后的培养基按规定的温度培养7天。3.6结果判定3.6.1如培养基均为澄清的蓝色或显浑浊但经证明并非有菌生长，判定为合格。3.6.2如培养基中任何一管蓝色消失、显浑浊或有菌膜并确证为有菌生长，判定为不合格。3.6.3监测结果只有在阳性对照的生物指示剂有菌生长时才有效。除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为不合格。3.6.4如果出现阳性结果，增加生物指示剂放置数量和位置点数，重复灭菌周期。如果再次出现阳性结果，对灭菌柜、操作过程等相关因素进行调查。