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PCR常见问题、原因分析及其对策北京天为时代科技有限公司主讲人：欧阳志荃PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略主讲内容PCR技术简介PCR标准反应体系•DNA模板•引物•反应缓冲液•dNTP•ddH2O•耐热聚合酶反应体系对PCR扩增的影响DNA模板•纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应•完整性模板降解会导致PCR扩增无产物•浓度加量过多导致非特异性扩增增加•特异性长度适当、避免二级结构和二聚体•完整性避免反复冻融•浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则引物扩增产物太少反应体系对PCR扩增的影响反应Buffer•pH值,盐离子浓度•稳定剂,增强剂Mg2＋浓度•过高非特异性严重•过低无扩增产物dNTPMixture•浓度适当•避免反复冻融ddH2O•pH值适当•避免污染PCR标准反应体系•DNA模板•引物•反应缓冲液•Mg2＋•dNTP•ddH2O•耐热聚合酶如何选择最合适的DNA聚合酶•DNA聚合酶的特性•PCR实验的不同需求如何选择最合适的DNA聚合酶－－DNA聚合酶的特性纯度稳定性酶活性如何选择最合适的DNA聚合酶－－PCR实验的不同需求长片段扩增PCR试剂盒扩增效率保真性特异性基因组扩增、RT-PCR基因筛选、测序、基因克隆复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）构建基因图谱、测序、分子遗传学复杂模板扩增、大规模基因检测特异性－热启动Taq酶原理•蜡封•抗体抑制•化学修饰特点•避免非特异性扩增•提高PCR反应的特异性用途•基因组扩增•RT-PCR－热启动Taq酶特异性产品类型产品名称产品性能化学修饰•天为时代:HotStartTaq•Roche:FastStartTaq•Abgene:Thermo-start®DNAPolymerase•Stratagene:SureStart™Taq•大大提高PCR反应的特异性•化学修饰不影响后续实验抗体抑制•Invitrogen：AccuPrimeTMTaqPlatinum®Taq•TaKaRa：ExTaqTMHotStartVersion蜡封Promega：TaqBeadTMHotStart保真性—高保真酶原理用途•3’－5’核酸•表达基因的克隆•基因的定点突变•细胞内基因点突变分析（SNP）外切酶活性•降低碱基错配率保真性—高保真酶产品类型生物公司性能比较PfuDNAPolymerase•天为时代•Stratagene•Promega在目前已发现的所有耐热聚合酶中,Pfu保真度最高碱基错配率最低PyrobestTMDNAPolymeraseTaKaRaTliDNAPolymerasePromega高保真＋高扩增效率原理•混合酶－高扩增效率－3’－5’核酸外切用途•超长片段扩增－测序－构建基因图谱•复杂模板扩增－GC含量高－二级结构高保真＋高扩增效率特点产品性能高扩增效率•天为时代：TaqPlus•TaKaRa：ExTaqTM复杂模板扩增高保真•天为时代：TaqPlatinum•Invitrogen：PfxPlatinumTaqHighFidelity保真度低于Pfu聚合酶但扩增效率较高长片段扩增•天为时代：LongTaq•TaKaRa：LATaq•Invitrogen：ElongaseAmplificaitonSystem特别适用于保真度较高的超长片段扩增PCRMasterMix原理预配好的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂PCRMasterMix特点•快速简便减少加样误差和污染•灵敏度高可扩增低至2个拷贝的目的模板•特异性强降低PCR反应的要求，增强特异性•稳定性好长期放置活性无改变适用范围•大规模基因检测•目的基因拷贝数极低的样本•GC含量高,有二级结构的模板•复杂基因组样本•可直接检测菌落，基因点突变检测,或者阳性克隆的筛选。PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略PCR常见问题、原因分析及其解决方案PCR常见问题•无扩增产物•非特异性扩增•拖尾•假阳性PCR常见问题之一•无扩增产物1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短原因对策1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；PCR常见问题之二•非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCR常见问题之二1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多原因对策1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数•非特异性扩增PCR常见问题之三•拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12PCR常见问题之三1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多原因对策1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数•拖尾PCR常见问题之四•假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染现象：空白对照出现目的扩增产物对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略提高PCR反应特异性的策略•巢式PCR（Nest-PCR）四种策略•递减PCR（TouchDownPCR）•热启动PCR（HotStartPCR）•使用PCR增强剂策略之一•巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。策略之二•递减PCR（TouchDownPCR）递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之三•热启动PCR（HotStartPCR）热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。策略之四•使用PCR增强剂甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适当谢谢！北京天为时代科技有限公司http//免费咨询：800－810－2177广东特约代理商广州英韦创津生物科技有限公司联系电话：020-875988678753485287534875