基因工程

名词解释：1.启动子：启动子（promoter）是基因表达调控的重要顺式元件，是DNA链一段能被RNA聚合酶识别和结合并能起始mRNA合成的DNA序列，位于结构基因转录起始点上游。2.基因工程：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行剪切和组合，然后与载体拼接，并通过载体转入到另一种生物体（受体）内，使其按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。3.表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件，使目的基因能够表达的载体。4.转化：DNA分子通过与细胞膜结合进入受体细胞并在细胞内稳定维持和表达的过程。5.插入失活：外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表性特征。6.YAC：酵母人工染色体，是进行大片段克隆的线状载体。7.退火：当温度突然降低时，反应体系中寡核苷酸引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。8.cDNA文库：是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA与适当的载体连接后转化受体菌形成的重组DNA克隆群。9.MCS：多个限制酶的单一切点，即多克隆位点。10.同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。11.COS质粒：考斯质粒是一类人工构建的含有λDNAcos序列和质粒复制子特殊类型的载体。12穿梭载体：是指能在两种不同的生物中复制的载体。13.Ti载体：利用土壤根癌农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞的质粒构建成的载体。14.基因文库：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。15.融合型表达蛋白：蛋白质的N未端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码，蛋白质由一条短的原核多肽或具其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称融合蛋白。16.反转录酶：是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。17.末端转移酶：一种能将脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)加到某DNA片段上3′-OH基上的酶。18.碱性磷酸酶：催化有机单磷酸酯水解为磷酸和甘油的非特异性酶。19.Sl核酸酶：来源于稻谷曲霉，是一种高度单链特异的核酸内切酶，催化降解单链DNA或单链RNA，产生以5′-磷酸基末端的单核苷酸或寡核苷酸的酶。20.平台效应：由于循环次数增加，引物、dNTPs被消耗，酶活性下降，退火时模板互补链间的复性也逐渐增加，扩增效率下降，扩增产物由指数形式变成线性形式，最后出现平台效应。21.染色体步查：是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。22.回文序列：又称反向重复序列,它在DNA或RNA中形成发夹结构，在DNA中有可能形成十字形结构。23.目的基因：以修饰受体细胞遗传组成并表达其遗传效应为目的的基因。24.同裂酶：能切割同一靶序列识别的限制性内切酶。25.衰减子：衰减子是指mRNA分子的前导序列(翻译起始点到5’端间的距离)中控制蛋白质合成速率的调节区。26.SD序列：在mRNA上起始密码子AUG上游4-13个核甘酸之前有一段富含嘌呤的序列，其一致序列为AGGAGG，能够与16srRNA3’末端的富含嘧啶的序列结合。27.α-互补：LacZ′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，这种现象称为α互补。PACE基因组文库简并序列CDNA-RDASSH基因的化学合成DNA体外重组同聚合物加尾法衔接物转化感受态细胞感染转染筛选增强子沉默子终止子衰减子核基质结合区核酸酶限制性内切核酸酶粘性末端平末端同切点酶酶的星号活性DNA连接酶DNA聚合酶5’→3’聚合酶活性3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性TaqDNA聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶外切核酸酶脱氧核苷酸酶1核糖核酸酶A载体克隆载体表达载体质粒载体质粒的不相容性噬菌体载体黏粒克隆载体噬菌粒载体人工染色体质粒表达载体大片段表达载体RNAiVIGS简答题：1.影响限制性内切酶活性的因素有哪些？（5分）DNA样品的纯度、DNA样品的甲基化程度、核酸内切酶的缓冲液性质、DNA的分子结构、酶切消化反应的温度2.作为基因工程的载体应具备哪些条件？（4分）(1)具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）(2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点(3)具有较高的外源DNA的载装能力(5)具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点(6)具有合适的筛选标记3.YAC载体包含有哪些元件？（5分）酵母DNA的端粒（TEL）、DNA复制起点（ARS）、着丝粒（CEN）和必要的选择标记（HISA4和TRP1）基因序列克隆到E.coli质粒pBR322中，构建成YAC克隆载体。4.基因工程受体细胞应具备的条件？（1）限制性缺陷型：外切酶和内切酶活性缺陷；（2）重组整合缺陷型：用于基因扩增或高效表达的受体细胞；具有较高的转化效率；具有与载体选择标记互补的表型；（3）感染寄生缺陷型：防止重组细菌扩散污染，生物武器除外。5.影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？X（1）连接所用的目的片段的状态（2）连接温度（3）反应液中的成分（4）插入片段与载体的浓度比例6.限制性内切酶的三种切割方式？按切割位点相对于二重对称轴的位置来区分（1）一种是在对称轴5’侧切割产生5’粘端，（2）另一种是在对称轴的3’侧切割产生3’粘端，（3）第三种切割方式是在对称轴处切割，就产生平末端。7.II型限制性核酸内切酶识别识DNA序列的结构特点？（1）识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列（2）大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧（3）识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构8.什么是蓝白斑筛选法？这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在l载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌b—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的l载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。9.绘图说明如何实现目的基因的定向连接？10.构建质粒克隆载体的基本策略有哪些？（1）能在受体细胞中有效复制，而且有较多的拷贝数，选择松弛型质粒复制起始子(Ori)。（2）含有尽可能多供外源DNA克隆的位点(MCS)。（3）必须含有供选择克隆子的标记基因。（4）克隆载体DNA的分子量尽可能的小，转化效率高,插入的外源片段较大。（5）根据需要，组装各种“元件”，构建不同用途的载体。11.T4-DNA酶的基本特性有哪些？（1）5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性。（2）在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切。（3）在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止。（4）在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。12.基因文库的质量标准有哪些？（1）重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力（2）载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆（3）克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序（4）克隆片段易于从载体分子上完整卸下（5）重组克隆能稳定保存、扩增、筛选13.Klenow酶的基本用途有哪些？（1）补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端（2）DNA片段的同位素末端标记（3）cDNA第二链的合成（4）双脱氧末端终止法测定DNA序列14.基因文库构建的基本步骤？（8分）(1)DNA提取及片段化(2)载体的选择及制备。(3)DNA片段与载体连接。(4)重组体转化宿主细胞。(5)转化细胞的筛选。15.简述基因工程的基本步骤，构建基因组文库需要用到哪些载体？（1）提取目的基因→→DNA分子（克隆载体）→DNA分子（2）转化：将重组DNA分子转入受体细胞、复制、保存（3）筛选和鉴定：对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定（4）检测：对含有重组DNA的细胞培养，检测外源基因的表达。质粒、λDNA、考斯质粒、BAC、YAC16.如何对大肠杆菌的λ噬菌体DNA进行改造用作基因工程载体？（1）l-DNA载体的构建：缩短长度（2）l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点（3）l-DNA载体的构建：加装选择标记（4）l-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体17.基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？（1）E.coliDNA聚合酶I（2）E.coliDNA聚合酶I的klenow片段（3）T4噬菌体DNA聚合酶（4）T7DNA聚合酶（5）TaqDNA聚合酶（6）反转录酶等18.CaCl2法质粒转化的原理及影响转化率的因素有哪些？19.重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。（？）（一）遗传表型直接筛选法（1）根据载体选择标记初步筛选转化子（抗药性筛选法/插入表达法/插入失活筛选法/显色互补筛选）（2）营养缺陷型检测法（3）形成噬菌斑筛选法（二）依赖于重组子结构特征分析的筛选法（三）核酸分子探针杂交检测法（四）免疫化学检测法（五）基因表达产物分析法（六）DNA测序法20.如何提高克隆基因的表达水平？（1）增加基因的拷贝数(2)构建增加转录的载体（3）构建融合型载体（4）构建分泌型克隆表达载体21.克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些类型？非融合蛋白、融合蛋白、分泌蛋白22.什么叫转基因植物？植物转基因技术的基本路线主要包括哪些？通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。(1)目的基因的分离(2)将目的基因克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，并且连接了一个控制目的基因转录表达的启动子和一个控制目的基因转录终止的终止子，还连接一个编码特殊蛋白质（如荧光蛋白）的标记基因。(3)利用细菌繁殖扩增重组DNA。(4)利用基因枪、农杆菌等方法将连接了启动子和终止子的目的基因导入到目标植物的细胞中。(5)筛选含有外源基因的转化细胞，并诱导产生转基因植株。(6)大规模种植转基因植物。23.外源基因导入植物的方法主要有哪些？（？）第一类：融合法，包括细胞融合，微细胞介导融合。第二类：化学法，包括DNA-磷酸钙沉淀法，DEA葡聚糖法，染色体介导法。第三类：物理法，显微注射法，电脉冲法，细胞速冻存法，基因枪法。第四类：感染法：重组DNA病毒感染法，农杆菌介导感染法。/（一）DNA直接转移法1）化学刺激法；2）电击法；3）显微注射法；4）基因抢法；5）脂质体介导法；6）微激光束法；7）花粉通道法；（二）载体介导法1）农杆菌介导法；2）植物病毒DNA介导法：24.出现转基因沉默现象的可能原因分析。（？）（1）DNA序列的甲基化。通常是胞嘧啶甲基化形成5’-甲基胞嘧啶。在转基因的启动子区，高GC序列区是甲基化的目标。（2）重复拷贝之间的异位配对。多拷贝的转基因串联染色体同一位点或分散在不同位点，均不同程度导致转基因失活。重复基因协同作用时，可能通过异位配对造成染色体的构型改变，从空间结构上阻碍转录因子与转基因的接触，导致基因处于关闭状态，形成基因沉默。（3）转录后调控的影响转基因转录启动后，转录酶将以连续方式产生正常RNA和反义RNA，二者形成dsRNA，干扰mRNA的加工与转译，形成衰退调控（down-regulation）。转基因转录启动后，mRNA的加工、转移与输出受到抑制。/1）位置效应2）DNA序列的甲基化3）重复拷贝之间的异位配对4）共抑制25．在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateaueffect），请问什么叫平台效应？产生平台效应的原因有哪些？平台效应：PCR进行到一定次数后产物的积累由指数方式向线性方式变化或反应根本停止。/PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：（1）底物与引物的浓度降低（2）dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低