第十一章-转录讲解

第11章RNA的生物合成RNABiosynthesis(Transcription)转录(transcription)生物体以DNA为模板在RNA聚合酶催化下，以4种三磷酸核苷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）为原料合成RNA的过程。转录RNADNA参与转录的物质原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)Mg2+和Mn2+其他蛋白质因子原核生物转录的模板和酶Templates&EnzymesinProkaryoticTranscription第一节一、原核生物转录的模板DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。不对称转录(asymmetrictranscription)的两方面含义：其一是在DNA分子双链上，一股链用作模板指引转录；另一股链不转录；其二是模板链并非总是在同一单链上。5'3'3'5'5′3′5′3′DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作-链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为+链或Crick链。5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C编码链模板链mRNA蛋白质转录翻译二、RNA合成由RNA聚合酶催化（一）RNA聚合酶能直接启动RNA链的合成DNA依赖的RNA聚合酶催化合成RNARNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似(NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPiRNA延长的RNADNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。RNA聚合酶和DNA的特殊序列——启动子(promoter)结合后，就能启动RNA合成。亚基功能决定哪些基因被转录与转录全过程有关（催化）’结合DNA模板（开链）ω功能尚不清楚辩认起始点全酶核心酶（二）RNA聚合酶由多个亚基组成βασωαβ’图12-5E.coliRNA聚合酶的亚基组成核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)转录起始阶段转录延长阶段ωRNA聚合酶的作用1)识别启动子。主要依赖于亚基，亚基只参与转录的起始，并决定转录的方向。2)与DNA结合并使之解链，另外还具有解旋、重新使DNA螺旋化作用。3)催化RNA聚合反应，负责三种RNA合成。4)RNA聚合酶核心酶通过与不同的亚基结合，识别不同的启动子。其他原核生物的RNA聚合酶，在结构、组成、功能上均与E.coli相似。原核生物的RNA聚合酶都受一类抗结核药利福平或利福霉素的特异性抑制。这类药物能与RNA聚合酶的亚基特异结合，从而影响酶的活性。三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上起启动转录原核生物每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。调控序列中的启动子(promoter)是RNA聚合酶结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。5'3'3'5'调控序列结构基因启动子RNA-polRNA聚合酶保护法转录开始TTGACAAACTGT-35区TATAATATATTA-10区+1+10-30-50-10-40-20533555RNA聚合酶保护区结构基因33用RNA聚合酶保护法研究转录起始区以DNA模板链上转录RNA链5’端的第一位核苷酸定义为+1，相邻的上游核苷酸为负值，下游记为正值。N17TTAACTN7AN16TATGATN7AN17TATGTTN6AN16TATAATN7AN18TACTGTN6ATTTACATTTACATTGACATTGATACTGACGtrptRNATrplacrecAara－　区－　区3510+1最大一致性TTGACATATAATx/45383629373728402530412944tRNAtrp原核生物启动子－35区（5-TTGACA-3）是RNA-pol对转录起始的辨认位点。辨认结合后，酶向下游移动，达到－10区（5-TATAAT-3，又叫Pribnow盒），此处更易发生解链，与RNA聚合酶形成开链复合物。RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合ω原核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninProkaryote第二节RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。一、转录起始需要RNA聚合酶全酶转录起始需解决两个问题：2.DNA双链局部解开约17bp，形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)；1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closedtranscriptioncomplex)；3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+PPi转录起始过程RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3转录起始复合物第一个磷酸二酯键生成后，σ亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于DNA模板上，酶沿DNA链前移，进入延长阶段。二、原核生物的转录延长时蛋白质的翻译也同时进行1.亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi转录泡(transcriptionbubble)在转录延长过程中，由局部打开的DNA双链、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者结合在一起的复合体，为空泡状结构，又称转录复合物。转录空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）····DNA····RNARNA\DNA杂交双链（8-9bp）E.coli的转录起始和延长原核生物转录过程中的羽毛状现象53DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；转录尚未完成，翻译已在进行。这种形状说明：依赖Rho因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止三、原核生物转录终止分为依赖(Rho)因子与非依赖ρ因子两大类转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物转录终止分为：同亚基六聚体蛋白能结合RNA，对polyC的结合力最强ATP酶活性和解旋酶(helicase)活性（一）依赖ρ因子的转录终止ρ因子依赖因子的转录终止（Rho）因子有ATPase和解旋酶活性。能与转录产物RNA结合，使自身和RNApol发生构象改变，RNApol停顿，DNA-RNA杂化链拆离，利于转录产物释放。ATP（二）非依赖ρ因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。茎环结构使转录终止：RNA聚合酶变构，转录停顿；转录复合物趋于解离，RNA产物释放。5pppG5335RNA-pol复制和转录的区别A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA（半保留复制）产物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录（不对称转录）两股链均复制模板转录复制A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA（半保留复制）产物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录（不对称转录）两股链均复制模板转录复制真核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninEukaryote第三节真核生物的转录过程复杂转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。转录终止也不相同。一、真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶真核生物具有3种不同的RNA聚合酶RNA聚合酶Ⅰ（RNAPolⅠ）RNA聚合酶Ⅱ（RNAPolⅡ）RNA聚合酶Ⅲ（RNAPolⅢ）所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基组成。有些亚基是三种酶所共有。mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的，需经常重新合成。因此RNA聚合酶Ⅱ是三种酶中最活跃的。RNA聚合酶Ⅱ由12个亚基组成，其最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensussequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)。CTD对于维持细胞的活性是必需的。CTD作用：CTD磷酸化对调控基因转录有重要作用：（1）CTD去磷酸化，RNA聚合酶II易与DNA结合，这种构象适于转录的起始；（2）CTD磷酸化可使RNA聚合酶II与DNA的结合变得松弛，形成适于延伸的构象二、转录起始需要启动子、RNA聚合酶和转录因子的参与（一）转录起始前的上游区段具有启动子核心序列不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA序列，这些序列可统称为顺式作用元件(cis-actingelement)。顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件(upstreampromoterelementsorpromoter-proximalelements)等近端调控元件和增强子(enhancer)等远隔序列。起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hogness盒或TATA盒(TATAbox)。通常认为这就是启动子的核心序列。真核生物RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子共有序列保守的共有序列：位于转录起始点附近的起始子(intiator，Inr)各种调控序列启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列，多在转录起始点约-40～-100nt的位置，比较常见的是GC盒和CAAT盒。增强子是能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒增强子顺式作用元件(cis-actingelement)AATAAA切离加尾转录终止点修饰点外显子翻译起始点内含子OCT-1OCT-1：ATGCAAAT八聚体（二）转录因子能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ转录因子亚基组成和(或)分子量(kDa)功能TFⅡDTBP38结合TATA盒TAF辅助TBP-DNA结合TFⅡA12，19，35稳定TFⅡD-DNA复合物TFⅡB33促进RNA-polⅡ结合及作为其他因子结合的桥梁TFⅡF30，74解旋酶；与RNA-polⅡ牢固结合形成TFⅡF/polⅡ复合物TFⅡE57()，34(β)ATP酶；解旋酶；引入TFⅡHTFⅡH蛋白激酶活性，使CTD磷酸化；ATP酶；解旋酶Ⅱ型基因中的四类转录因子转录因子具体组分结合序列功能基本组分TBP，TFⅡA，B，E，G，F和HTBP结合TATA盒转录起始定位；转录起始和延长辅激活因子TAFs和中介子在可诱导因子和上游因子与基本转录因子、RNA聚合酶结合中起联结和中介作用上游因子SP1、ATF、CTF等启动子上游元件协助基本转录因子，提高转录效率和专一性可诱导因子如MyoD、HIF-1等增强子等远隔调控序列时间和空间（组织）特异性地调控转录（三）转录起始前复合物真核生物RNA-