丙二醛MDA测定

丙二醛MDA测定测试所需仪器设备：可见光分光光度计，可调到95℃左右的恒温水浴箱（或者铝锅内放几个去掉盖子的易拉罐，将罐壁及底部穿数十个孔，以便水的进入，用来代替水浴箱）。离心机。100Ｔ试剂盒组成与配制：试剂一：液体20mL*1瓶，室温保存．（天冷时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用）。试剂二：液体12mL*1瓶，用时每瓶加340mL双蒸水混匀，4℃冷藏。试剂三：粉剂*1支，4℃冷藏。1.按规范操作方法来配制MDA3号试剂：将1支100Ｔ的MDA3号粉剂倒入烧杯内加90℃～100℃的热蒸馏水64mL,充分溶解（溶解过程中可适当加热）。冷却后加冰醋酸60mL混匀。2.再将上述配好的MDA3号试剂用50％冰醋酸按2：1进行稀释，用多少配多少。例如您需要用微量法测MDA需要试剂三为15mL，则可以取上述按规范操作法配好的试剂三10mL加冰醋酸5mL，混匀即可。配好的试剂避光4℃冰箱冷藏（冰醋酸自备）注：因蒸馏水热胀冷缩，加热过程要蒸发，本应加60mL现多加4mL，冷却后在60mL。50％冰醋酸的配制是50mL双蒸水加50mL冰醋酸混合而成的。冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司均有售，要购AR级分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为99％以上。用时将粉剂加入到90℃～100℃的热双蒸水60mL中，（在溶解过程中可适当加热），充分溶解后用双蒸水补足至60mL再加冰醋酸60mL，混匀，配好的试剂避光冷藏。冰醋酸自备。标准品：10nmoL/mL四乙氧基丙烷5mL*1瓶，4℃冷藏。测试盒冷藏至少可保存一年。操作步骤：标准管标准空白管测定管测定空白管**10nmoL/mL标准品（mL）a*无水乙醇（mL）a*测试样品（mL）a*a*试剂一（mL）a*a*a*a*混匀（摇动几下试管架）试剂二（mL）1.51.51.51.5试剂三（mL）1.51.51.550％冰醋酸（mL）1.5旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸40分钟），取出后流水冷却，然后3500～4000转/分，离心10分钟，取上清***，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。a*表示所取的样品量，标准品量，无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等，例如样品取0.1mL，则标准品、无水乙醇及试剂一也取0.1mL，若样品取0.2mL，则标准品、无水乙醇及试剂一也取0.2mL。因吸光度与加样量呈正比曲线，因而结果不受影响。**一般情况下，标准管、标准空白及测定空白管每批只需做1～2只，若测定管中蛋白量不是太高，则测定空白管可以不测，用标准空白管来代替测定空白管。***吸取上清比色时了好用移液器吸取上清加入比色皿中，尽量避免倾倒，以免沉淀进入比色皿，影响吸光度。注1.用此方法，所测各管吸光度值比规范操作方法要高，但不影响最终结果。注2.5％组织匀浆a*取0.1～0.2mL进行检测较好。注3.若发现检测样本吸光主葢低，可以将水浴时间40分钟延长至80分钟，但您的同一课题中MDA的检测都必须延长至80分钟，以免造成批间差异。注4.此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1mL时，则标准管吸光度减去标准空白管吸光度为0.103～0.112。当标准品取样量为0.2mL时，则标准管吸光度减去标准空白管吸光度为0.206～0.224。计算公式1.计算公式：（１）血清中MDA含量计算公式：样本测试前稀释倍数标准品浓度（白管吸光度标准管吸光度－标准空白管吸光度测定管吸光度－测定空＝含量（血清中)/10)/mLnmoLmLnmoLMDA（２）组织中MDA含量计算公式：)/)/10*)/mLmgprotmLnmoLmgprotnmoLMDA蛋白含量（标准品浓度（白管吸光度标准管吸光度－标准空白管吸光度测定管吸光度－测定空＝含量（组织中*nmol/mgprot为纳摩尔/毫克蛋白超氧化物歧化酶（SOD）测试盒100管试剂盒的组成与配制试剂一：贮备液：10mL*1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用），试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100mL，4℃保存。试剂二：液体10mL*1瓶，4℃～10℃保存。试剂三：液体10mL*1瓶，4℃～10℃保存。试剂四：液体350μL*2支，4℃保存，不可冷冻；4号稀释液10mL*1瓶，4℃保存。用时二者按1：14稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4℃保存，不可冷冻。配好后可保存2～3个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。试剂五：粉剂*１支，用时加70℃～80℃热双蒸水75mL，配好后的试剂避光4℃冷藏。试剂六：粉剂*1支，用时加蒸馏水75mL溶解后备用，配好后的试剂避光4℃冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五：试剂六：冰乙酸＝3：3：2的体积比配成显色剂，4℃冷藏。操作总SOD(T-SOD)活力的测定：试剂测定管对照管试剂一（mL）1.01.0样品（mL）a*蒸馏水（mL）a*试剂二（mL）0.10.1试剂三（mL）0.10.1试剂四（mL）0.10.1用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟显色剂（mL）22混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。计算（一）血清总ＳＯＤ活力计算：1.定义：每毫升反应液中ＳＯＤ抑制率达50％时所对应的ＳＯＤ量为一个ＳＯＤ活力单位（Ｕ）。2.血清总SOD活力计算公式：样本测试前的稀释倍数　　　　　　　　　　　反应体系的稀释倍数％对照管吸光度测定管吸光度对照管吸光度活力（总50)/mLUSOD3.计算举例：测血清中总SOD的活力，取血清30μL，测定对照管吸光度为0.465，测定管吸光度为0.298。将数据代入计算公式：毫升）（活力单位＝　　　　　　　　　　（所取样品量）（反应液总量）％＝活力（//73.7903.033.350465.0298.0465.0)/mLUmLUSODT（二）组织匀浆中总SOD的活力计算：1.定义：每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（Ｕ）。2.计算公式：)/)50)/mLmgprotmLmgprotUSOD组织中蛋白含量（取样量（反应液总体积　　　　　　　　　　　　　　　　　％对照管吸光度测定管吸光度对照管吸光度＝活力（组织匀浆中3.计算举例：取1％肝组织匀浆10μL测总SOD的活力，对照管吸光度为0.510，测定管的吸光度为0.242，测得组织蛋白为1.075mg/mL。则计算结果为：mgprotUmgprotUSOD/60.323075.101.031.3%50510.0242.0510.0)/活力（总Mgprot为毫克蛋白数总抗氧化能力的测定所需仪器设备721或722分光光度计、水浴箱测试盒组成与配制：（50Ｔ）试剂一：液体60mL*2瓶，4℃保存。试剂二：粉剂*2支，用时每支加双蒸水至120mL，室温保存。试剂三：黄色贮备液10mL*1瓶，避光冷藏保存。贮备液的稀释液60mL*1瓶。试剂三应用液的配制：临用前取贮备液以稀释液稀释，比例为1：19。需多少配多少。试剂四：溶液24mL*1瓶，室温保存。试剂五：溶液24mL*1瓶，室温保存（天冷时会凝固，每次测试前适当加温以加速溶解，直至透明方可使用）。简便操作表1.混合试剂的配制：测试前，将试剂一、二、三每种试剂所用量乘以样本数（n）再乘以2（因每只测定管均需做对照管），然后再加上放宽的4只，即n*2+4,混合试剂的具体配制见下表：试剂名称试剂一试剂二试剂三试剂用量（mL）（n*2+4）*1（n*2+4）*2（n*2+4）*0.5将上面所有试剂按顺序加在一起混匀制成混合试剂。混合试剂需现用现配。2.血清、全血简便操作表：对照管测定管待测样本（mL）a混合试剂（mL）3.53.5旋涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟试剂四（mL）0.10.1待测样品（mL）a*旋涡混匀器充分混匀，放置10分钟，双蒸水调零，1cm光径，520nm处，测各管吸光度。3.组织样本简便操作表对照管测定管10％组织匀浆（mL）a混合试剂（mL）3.53.5旋涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟试剂四（mL）0.20.210％组织匀浆（mL）a*试剂五（mL）0.20.2旋涡混匀器充分混匀，放置10分钟，双蒸水调零，1cm光径，520nm处，测各管吸光度。