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第四章植物脱毒技术一、引言多数农作物，特别是无性繁殖作物，都易受到一种或一种以上病原菌的周身浸染。例如，已知草莓能感染62种病毒和类菌质体，因而每年都必须更新母株。病原菌的侵染不一定都会造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见症状。然而，在植物中病毒的存在会减少作物的产量和（或）品质。据报道，当以特定的无毒植株取代了被病毒侵染的母株之后，产量最多可增加300％（平均为30％）。因此，为了提高产量和促进活体植物材料的国际交换，根除病毒和其他病原菌是非常必要的。虽然通过杀细菌和杀真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物处理可以治愈受病毒侵染的植物。作物，特别是无性繁殖。由于大部分病毒都不是通过种子传播的，因此，若是使用未受侵染或侵染程度较轻的个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。不过有性繁殖后代常常表现遗传变异性，在园艺和造林业中，品种的无性繁殖十分重要，而这一般都是通过营养繁殖实现的。如果在一个品种中，并非全部母株都受到了侵染，那么只要选出一个或几个无病株进行营养繁殖，也有可能建立起无病的核心原种。但是，若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病植株的惟一办法，就是由该植株的营养体部分把病原菌消除，并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带病原菌的植株，然后就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。众所周知，病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很低的病毒。在较老的组织中，病毒数量随着与茎尖距离的加大而增加。分生组织所以能逃避病毒的侵染，可能的原因是：①在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖；②在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制；③倘若在植物体内确实存在着“病毒钝化系统”的话，它在分生组织中应比在任何其他区域都有更高的活性，因而分生组织不受侵染；④在茎尖中存在高水平内源生长素，可以抑制病毒的增殖。茎尖培养不但可以去病毒，而且可以去掉所有的病原菌(包括细菌、真菌等）二、通过热处理消除病毒基本原理，在高于正常的某一温度范围（35－40℃)下，植物组织中的很多病毒可被部分地或完全钝化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。热处理，可通过热水或热空气进行。热水对休眠芽效果较好；热空气对活跃生长的茎尖效果较好。处理时间的长短，可由几分钟到数周不等。例如，麝香石竹在38℃下处理2个月，从而消除了茎尖内的所有病毒。然而，马铃薯病毒X（PVX）则要求在35℃下处理几个月才能得到一些无病毒茎尖。热处理之后要立即把茎尖切下来嫁接到无病毒的砧木上去（这是对于难以生根的植物而言，易于生根的可以直接接到培养基上。热处理时，最初几天空气温度应逐步增高，直到达到要求为止。若钝化病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当试验高低温交替的效果。在热处理期间应当保持适当的湿度和光照。而且要对植物进行修剪，以增加植物忍受热处理的能力。应用热疗法消除病毒的一个主要限制在于，并非所有的病毒都对热处理敏感，例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒（leafroolvirus）。和单独采用热疗法相比，茎尖培养具有更广泛的适用性。很多不能由单独的热处理消除的病毒，可以通过茎尖培养和热处理相结合，或单独的茎尖培养而消除。因而，茎尖培养现在已经成为消除病毒的一个很常用的手段。茎尖（shoottip),约0.1－1mm，多数是由茎尖培养得到去病毒植株。或者是茎的顶端分生组织（apicalmeristem)0.25mm以内。三、方法解剖镜（体视显微镜），解剖针，解剖刀。为了防止茎尖变干，要在衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖。茎尖外植体要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸钠消毒（10分钟）。在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。当形似一个透明闪亮的半球形顶端分生组织暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来，上面可以带有叶原基，也可不带，然后用同一工具接种到培养基上。对于难以生根的要嫁接到健康的砧木上。注意，不要太大，以免带有较老的组织。四、茎尖培养中影响脱毒效果的因素（一）培养基MS培养基是常用的较好的适于茎尖培养的培养基之一。下表是几种常用于茎尖培养的培养基。虽然较大的茎尖外植体（500μm）或更长在不含生长调节剂的培养基中也能产生一些完整的植株，但一般来说，含有少量（0.1－0.5mg/L的生长素或细胞分裂素或二者皆有常常是有利的。在各种不同的生长素中，应当避免使用2，4－D因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定，效果更好。（二）外植体大小在最适培养条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。外植体越大，产生再生植株的机会也就越多，在木薯中，只有200μm长的外植体能够形成完整的植株，再小的茎尖或是形成愈伤组织，或是只能长根。小外植体可能也不利于茎的生根。然而，不应当离开脱毒效率（它与外植体的大小呈负相关）单独看待外植体的存活率，因此，外植体应小到足以能根除病毒，大到足以能发育成一个完整的植株。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力。大黄离体顶端分生组织必须带有2～3个叶原基。Mrashige（1970）等虽然证实了不带叶原基的离体顶端分生组织有可能进行无限生长，并发育成完整的植株，但他们认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节剂的培养基中，离体顶端分生组织可能在组织重建过程中迅速形成双极性轴。虽然培养不带叶原基的顶端分生组织是可能的，但对于脱毒来说，看来并不实际可行。正如Murashige所说的，“如果培养方法得当，用较大的茎尖做外植体，其消毒的效果并不一定比只用分生组织差。”（三）、培养条件在茎尖培养中照光培养通常都比暗培养的效果好。在马铃薯中建立茎尖培养物的最适光照强度是100lx，但4周后应增加到200lx。当茎已长到1cm高时，光照强度应进一步增加到4000lx。温度通常是25℃+2℃。(四)、外植体的生理状态茎尖最好是由活跃生长的芽上切取。在麝香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。但在草莓中Boxus（1977）没有看到这种差别。即使在腋芽比顶芽表现较差的情况下，为了增加脱毒植株的总数也还是要采用腋芽，这是因为腋芽在每个枝条上有好几个，而顶芽只有一个。取芽的时间也是个重要因素，这对于温带树种，植株的生长只限于短暂的春季，此后很长时间茎尖进行休眠，直到低温或光打破休眠为止。在这种情况下，茎尖培养应在春季进行，而若要在休眠期进行，则必须采用适当处理。在李属植物中，取芽之前必须把芽保存在4℃下近6个月之久。茎尖培养的效率除取决于外植体的存活率和茎的发育程度之外，还取决于茎的生根能力及其脱毒程度。在麝香石竹中，虽然冬季培养的茎尖产生的茎最易生根，但夏季得到无病毒植株的频率最高。在所研究过的大多数马铃薯品种中，在春季和初夏采集的茎尖比在较晚季节采集的容易生根。(五)、热疗法尽管顶端分生组织常常不带病毒，但不能把它看成一种普遍现象。现有足够证据表明，某些病毒实际上也能侵染正在生长的分生区域。若把茎尖培养和热疗法结合起来，也有可能获得脱毒植株。热处理可以在切取茎尖之前的母株上进行，也可以在茎尖培养期间进行。应用前一个方法还有一个有点，即由受热处理之后的母株上，可以切取较大的外植体进行培养，因而可以增加能够存活并发育成无病毒植株的茎尖的百分数。在草莓中将热处理（36℃，6周）与茎尖培养结合起来，比单独茎尖培养对于消除温性黄边病菌和其他较稳定的病毒更有效。在大多数草莓品种中，热处理还能提高植株的生长速率。但高温处理的时间要慎重决定，时间太长，对于植株有伤害。（六）通过愈伤组织培养消除病毒在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都均匀一致的带有该种病原菌。已经由若干种植物的茎尖愈伤组织中再生出无病毒植株。在受病毒全面侵染的的愈伤组织中，某些细胞之所以不带病毒，可能是由于：病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；有些细胞通过突变获得了抗病毒的特性。由受到TMV病毒感染的烟草叶片取下1mm的外植体进行培养，在生植株中有50％是无毒的。据报道，在马铃薯茎尖愈伤组织再生植株中，不含PVX植株的频率（46％）比由茎尖直接产生的植株中的频率要高得多。不过，在考虑采用愈伤组织培养消除病毒的时候，不能忽略培养细胞在遗传上的不稳定性，以及某些农作物还不能由愈伤组织再生植株。（七）脱毒效果的检验最简单的方法，是检验叶和茎是否有该种病毒所特有的可见病症。病毒的汁液感染法（saptransmission)是一种用于检验病毒的所有方法中最为敏感的方法，由受检植株上取下叶片，置于等容积（W/V）的缓冲液（0.1mol/L磷酸钠）中，用研钵和研杆将叶片研碎。在指示植物（对某种或某些特定病毒非常敏感的植物）的叶片上撒上少许600号金刚砂，然后用受检植物的叶汁轻轻涂于其上。适当用力摩擦，以使指示植物叶表面细胞受到感染，但又不要受伤叶片。大约5min后，用水轻轻洗去接种叶片上的残余汁液。把接过种的指示植物放在一间温室或防蚜虫罩内，株间以及与其他植物间都要隔开一定距离。取决于病毒的性质和汁液中病毒的数量，大概要6～8d或是几周，指示植物即可表现症状。在进行马铃薯的脱毒效果检验时常用的指示植物有千日红、苋色藜、野生马铃薯、曼陀罗、辣椒等等。不过，一些植物病毒，如草莓黄化病毒和丛枝病毒等，不是通过汁液传染的，而是通过蚜虫传播的，在这种情况下，则须将脱毒培养后的芽嫁接到指示植物上，根据指示植物的症状表现，判断是否脱除了病毒。检验植物中是否存在着病毒的其他方法，还有血清测验法和电镜观察法。对于不表现可见症状的潜伏病毒来说，血清法和电镜法是唯一可行的坚定方法。（八）通过茎尖培养消除病毒的注意事项要想得到和繁殖一个品种的脱毒植株，首先必须了解有关该种植物的一些背景知识，特别是可能周身侵染该种植物的病原菌以及这种植物的繁殖方法等。然后应当检查实验植物是否携带所疑有的病原菌，并确定茎尖外植体的适当大小，能导致生长最快和最有可能消除病毒的培养条件。最后反复检查茎尖产生的植株是否还带有疑有的病原菌，并在能杜绝任何再侵染可能性的条件下，繁殖那些确已脱毒的植株。脱毒的好处：一方面可以提高产量和品质；另一方面可以促进植物活体材料的进出口。除了掌握组培技术外还有懂得病理学和温室栽培学等的知识。马铃薯脱毒程序1．在正常的温度和光照条件下，在土中种一块单芽眼块茎，当第一个芽长到约15cm高时，将顶端切下6～8cm长。去掉下面的2个叶片，在切日处涂上生根激素后，把切条植人一个口径为10cm内装消毒土壤的花盆中，然后用玻璃烧杯罩上，保持10d。2．植人花盆3～4周后，将其移人生长箱中，其中光照强度为3000～4000lx，光照时间每天16h，气温白天约为36℃，夜间约为33℃。3．2周后打掉幼株的茎尖，以促使腋芽的生长。4．经过6周的热处理之后，折下1个腋生枝以从其上取芽，在植株上至少留下2个叶片以促其进一步生长。由折下的腋生枝上剪去叶片，但要把一小段基部叶柄留在枝上。把这个腋生枝包在湿纸内以防枯萎。5.双筒解剖镜下，将茎尖解剖出来（枝条不必消毒）。方法是：把残留的叶柄向后拉，使腋芽暴露出来，用一根解剖针剥掉幼叶。6．当只剩下2个最幼小的叶原基时，用装在一根合适刀把上的一小片碎刀片切下茎尖（300～600um长），放在培养基上。7．在23℃，每天16h光照的条件下培养。8.当茎长到3cm甚至更长并已生根时，即可移人土壤。起初要把植株保持在高湿度的环境中，若有些品种茎不生根，可以把它们嫁接到无病的砧木上去。9.移入土壤后，立即对植株进行第一次带病毒情况的检查，数周后再进行一次。马铃薯病毒的指示植物是千日红