溶酶体分离与鉴定

溶酶体分离与鉴定关键词：细胞蔗糖溶液磷酸酶磷酸溶酶体试剂标准物质1.溶酶体的分离溶酶体为细胞质内由单层脂蛋白膜包绕的内含一系列酸性水解酶的小体，是细胞内具有单层膜囊状结构的细胞器。溶酶体内含有许多种水解酶类，其中多数适合在酸性条件下发挥作用。溶酶体直径约0.025～0．2gm，所以需要更大的转速才能获得。把分离线粒体时的上清液以16300g离心20分钟，弃上清，沉淀加入10ml预冷的0．25mol／L，蔗糖溶液悬浮，用同样的条件再离心1次。2溶酶体的鉴定(1)光镜直接观察：溶酶体的外形在光镜下不能看见，但可以看到棕黑色的颗粒和斑块。溶酶体可用酸性磷酸酶(ACP)显示法进行鉴定。ACP广泛存在于动物组织，主要定位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时，底物不容易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定后，在合适pH条件下，膜本身变得不稳定，底物可以渗入，酶活力被显示。此酶在pH5．0左右发生作用，能分解磷酸酯而释放出磷酸基，与底物形成沉淀。(2)电镜观察：溶酶体常指初级溶酶体或者前体溶酶体，电子密度相对较高，由大量细小的微粒填充，通常呈球形，直径约为25～200nm。电镜技术在溶酶体的形态学和功能学研究中发挥了重要的作用。(3)细胞学检测：LAMP1和LAMP2组成了50％的溶酶体膜蛋白，常规采用细胞免疫荧光的方法用抗体去结合LAMP1或者LAMP2蛋白，从而识别溶酶体。LAMP又名溶酶体相关膜蛋白，分为1型和2型，因为是溶酶体膜上特有的唾液酸糖蛋白，所以采用LAMP抗体标记溶酶体的方法特异性很强(图5-3-7)。此外，溶酶体染色还经常选择探针类染料，Lysotracker探针和Lysosensor探针。Lysotracker可以在活细胞里选择性地标记和追踪酸性细胞器，可自由进出细胞膜，标记溶酶体方便、高效、快捷、特异，作用机制可能是结合溶酶体膜并潴留在溶酶体内，缺点在于高浓度标记时特异性明显降低，且长期潴留细胞器会引起溶酶体内pH上升(图5-3-8)。Lysosensor探针则是细胞内的pH荧光指示剂，溶酶体内特异性的酸性环境可加强该探针的荧光强度，从而在荧光显微镜下可以判断荧光蓄积处茸为溶酶体所在。由于其荧光强度直接反映出溶酶体的pH变化，所以Lysosensor探针可以胃采醑究溶酶体的功能学，其缺点同样是长期潴留会导致溶酶体pH环境变化。此外，标记溶酶体还可采用celllight由BacMam病毒携带并表达。该方法将GFP或者RFP荧光蛋白连接到目标LAMP1序列上，一旦由病毒转染入细胞表达后，GFP或者RFP即可特异性地表达于溶酶体膜上。缺点在于LAMP1-GFP／RFP蛋白的过表达会引起内吞胞器的异常聚集。由于溶酶体的标记特异性，上述LAMP标记的细胞免疫标记方法，以及探针标记方法等均可行共聚焦扫描成像，获得细胞器显色清晰且背景干净的优质图像。