放射生物学2.电离辐射对DNA的损伤

电离辐射对DNA的损伤电离辐射对DNA的损伤•近年来，随着分子生物学技术与理论的飞速发展、有关生物大分子的辐射效应研究亦不断深入。•电离辐射所致生物大分子结构与功能的变化是整个机体、各种组织，细胞乃至亚细胞水平上的辐射生物效应的基础。它从微观角度反映了辐射敏感性的本质．为探讨和解决宏观领域中的实际问题提供了依据。•可以认为，对生物大分子辐射效应的研究，将成为目前和今后一段时间内放射生物学领域的重点和前沿课题。•细胞要成功地行使其职能，并且把它所包含的遗传信息正确无误地传递给子代，完全依赖于每一个脱氧核糖核酸分子(DNA)保持结构的完整。•核苷酸序列的改变，组成DNA双螺旋结构的碱基或糖在结构上的变动，都会干扰细胞基因组的复制或转录。•DNA的损伤是辐射生物效应的主要原因(包括细胞死亡，丧失再增殖能力，突变等)。电离辐射对DNA的损伤•因此，DNA损伤后的修复机制至关重要，修复过程会导致完全恢复原状或错误修复，后者将导致严重的实际后果，如致癌作用。•DNA是染色体的主要构成要素，而染色体则是把遗传信息传递给子细胞的工具。•染色体损伤或畸变是细胞群体受损的一种很好的指征，并有助于预测辐射效应。电离辐射对DNA的损伤主要内容•正常DNA分子结构•辐射所致DNA损伤的类型•DNA损伤的生物学意义•DNA辐射损伤的修复正常DNA分子结构•DNA是一个由4种单位组成的双螺旋大分子：•嘌呤碱基——腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）•嘧啶碱基——胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）正常DNA分子结构•和碱基相连接的一个糖分子（脱氧核糖），和糖相连接的一个磷酸分子。•核苷酸通过连接糖和磷酸分子的磷酸二酯键结合在一起。•DNA是由碱基间的氢键相连的两条互补链相成。正常DNA分子结构•腺嘌呤与胸腺嘧啶配对（A：T碱基对），鸟嘌呤与胞嘧啶配对（G：C碱基对），使DNA的一条链具有另一条链的互补序列。正常DNA分子结构•DNA很像一架旋梯，两边柱子由两条链组成，而台阶是由氢键连接的碱基组成，两条链以双螺旋形式盘旋在一起。•DNA复制期间两条链则解旋分离，每条链都可作为合成新的互补链的模板。辐射所致DNA损伤的类型•DNA链断裂（单链、双链）•DNA碱基损伤•DNA交联DNA链断裂•单链断裂（singlestrandbreak，SSB):在磷酸酯和脱氧核糖体之间的磷酸双酯键水平上发生，或者更经常是在碱基和脱氧核糖体之间的键水平上发生。DNA链断裂•双链断裂（doublestrandbreak，DSB)：包括DNA两条链相隔少于3个核苷酸的部位的断裂。•可以由单个粒子产生（传递能量约为300eV的电离辐射），或者由于两个粒子在第一个断裂有时间修复以前通过同一区域，从而在互补链中产生两个单链断裂组合而成。•假如断裂发生在同一个碱基对上则为同源性断裂，反之是异源性断裂，后者往往更频繁的发生。DNA双链中一条链断裂者称为单链断裂，(SingleStrandBreak,SSB)两条链在同一处或相邻处断裂者称为双链断裂，(DoubleStrandBreakBSB)DNA链断裂•DNA断裂主要与羟自由基（HO·）的作用有关。•水在辐射分解后产生三种主要的自由基，即水合电子(G＝2.7)，羟自由基(G＝2.7)和氢自由基(G＝0.55)。•水合电子加合至碱基上，不能引起糖基上的磷酸二酯链断裂。氢自由基主要加至碱基上，只有一小部分能从糖基上抽氢。•羟自由基也主要(约80％)加至碱基的双键上，但由于它的高反应性，能从糖基上抽去约20％的氢。DNA链断裂的主要特点1.单链断裂与双链断裂的比值•DSB约为SSB的1/10~1/20•SSB由一个自由基攻击引起。•DSB必须由两个以上自由基引起。•一定能量的射线所产生的SSB和DSB有一个大致的比值，但比值不是恒定的。1.单链断裂与双链断裂的比值•如以DNA链断裂的G值表示，γ噬菌体DNA在干燥状态下照射时，SSB的G值为0.7~1.1，而DSB的G值为0.06~0.16。•大鼠整体照射后分离肝细胞染色质，测得SSB的G值为1.5~2.0，DSB的G值为0.10。•有氧条件照射和无氧条件下照射相比，氧增强比约在2~5之间。2.LET对链断裂的影响•各种射线对链断裂效应的顺序：中子＞γ射线、χ＞紫外线•中子引起的DSB多于γ射线，而引起的SSB少于γ射线。•SSB与DSB的比值与LET高低有关。•随着LET的升高，SSB减少，DSB增多。3.氧效应对链断裂的影响氧效应可增加链断裂的程度：•主要原因是氧效应可增加羟自由基的产生。4.DNA链发生的部位•剂量不同，DNA碱基发生断裂的概率亦不同。•当剂量＜20Gy照射时，碱基断裂顺序G＞A＞T≥C。•当剂量＞40~80Gy照射时，碱基断裂顺序T＞G＞A≥C。DNA自然断裂的发生•通常情况下DNA断裂的本底水平可达总DNA的百分之几。•一般方法难以测量，常引入凝胶模块的方法来解决。碱基的损伤•在充氧情况下的照射，碱基的损伤主要是由于羟自由基(·OH)所致。•放射敏感性：胸腺嘧啶＞胞嘧啶＞腺嘌呤＞鸟嘌呤DNA交联（cross-linking）DNA交联分为三种形式：•a.DNA链间交联（一条链上的碱基与另一条链上的碱基以共价键结合）•b.DNA链内交联（同一链上的两个碱基相互以共价键结合）•c.DNA--蛋白质交联（DNA与蛋白质以共价键结合）（DNAproteincross-linking，DPC）DPC形成的分子机制•羟自由基（·OH）是导致DPC形成的最有效的自由基，而水合电子和超氧化阴离子在DPC的形成中似乎无作用。•如果受照细胞的悬液中存在着羟自由基清除剂二甲基亚砜，则DPC生成量明显减少。•相反，如果将细胞置于含有N2O的气体中照射，因N2O能使水合电子转变为额外羟自由基，DPC产额大为提高。氧效应对DPC形成的影响•氧效应对DPC形成有一定的影响。•有氧条件下进行紫外线照射→交联量增加•有氧条件下进行χ线照射→交联量减少；反之去除游离氧之后产生的交联反应增强。温度对DPC形成的影响•增温能增加肿瘤细胞DPC的形成而用于放射治疗的增敏。•将中国仓鼠卵巢细胞置于45.5℃保温17min，然后用x射线照射，可观察到与DNA交联的非组蛋白增加两倍。•如用增温处理HeLa细胞，DPC生成量随温度和保温时间直线上升。45℃保温30min，可使DPC增加1.57倍。•但也有报告指出，增温处理并不增加x射线引起的DPC，而是使DPC共价键的链型发生改变，处理后出现新的P-N键。2.DNA-DNA链间的交联•在DNA的化学损伤中，DNA-DNA链间交联是最重要的一类。•在放射生物学中研究DNA-DNA链间的交联的报道较少。DNA链间交联与DNA链断裂相互竞争。•在干燥及含25%水的DNA中链间交联占优势；随着水分子的增加DNA链断裂生成率上升，而链间交联下降。3.DNA链内交联----嘧啶二聚体的形成•二聚体的形成是指在辐射作用下，一个单链的2个相邻的碱基以共价键相连，两者之间形成一个环丁烷环。•二聚体的形成具有重要意义，因为它们在那一点上阻断了DNA的复制。•胸腺嘧啶二聚体（T-T）的形成最频繁而且又非常稳定，在受紫外线照射部位（脸、颈和手）引起皮肤癌的过程中，似乎起着重要作用。•二聚体形成是紫外线照射引起DNA的特征性改变。•电离辐射引起二聚体形成很少。3.DNA链内交联----嘧啶二聚体的形成DNA损伤的生物学意义•众所周知，DNA是细胞生长、发育、繁殖和遗传的重要物质基础．它蕴藏着丰富的遗传信息，通过转录和翻译，指导着蛋白质和酶的生物合成，主宰着细胞的各种生理功能。DNA损伤的生物学意义•DNA结构的完整与稳定在生物学上有着特别重要的意义。•在射线作用下，DNA碱基的损伤或脱落改变了密码，引起基因的点突变。DNA损伤的生物学意义•转换：一个嘌呤被另一个嘌呤所取代或一个嘧啶被另一个嘧啶所取代•颠换：一个嘌呤被另一个嘧啶所取代或一个嘧啶被另一个嘌呤所取代•碱基缺失、移码突变、碱基插入•这样经转录和翻译后就会形成功能异常的蛋白质和酶，引起细胞突变或癌变。DNA损伤的生物学意义•总之，DNA结构的辐射损伤在细胞的致突，致癌机制中起着重要作用，与细胞死亡反老化等过程亦有密切关系。•另外，细胞为了维护其生命和正常的机能活动，通过多种途径对各种类型的DNA损伤进行修复，决定细胞命运的不仅是损伤严重程度，其修复能力与修复机制亦十分重要。DNA损伤的生物学意义•无错修复有利于细胞恢复其正常机能．而易错修复将导致基因突变。•DNA损伤和修复的规律在肿瘤治疗方面具有重要的应用价值。•例如、有选择地加重肿瘤细胞的DNA损伤，抑制其修复，以增强其放疗、化疗和热疗的效果。•电离辐射可造成DNA结构和功能损伤。由此而引起的一系列生物学后果不仅取决于DNA的损伤程度，而且还决定于其修复能力。•许多研究工作均证实了DNA辐射损伤后修复过程的存在。•早在1935年，Hollaender通过观察大肠杆菌在紫外线照射后的存活情况，首次提出了修复的概念。DNA辐射损伤的修复•根据早期的研究工作，修复现象大体上可分为两种情况。•第一，将预定的照射剂量分次给予，生物效应则明显减轻。如用x射线分次照射中国仓鼠卵巢细胞，在4.87Gy照射后37℃保温10h，再照5.05Gy，所得存活率明显高于9.92Gy单次照射。表明在两次照射间隔中细胞有所恢复。这种修复称作亚致死损伤修复。DNA辐射损伤的修复•第二，在照射后改变细胞所处的状态和环境．如延迟接种或给予不良的营养和环境条件，均能提高存活率。•例如，大肠杆菌B/r在x射线照射后维持在18℃，小鼠淋巴白血病细胞L5178Y在x射线照射后以34°C处理，然后再以正常需要的温度培养，其存活率都比照后直接正常培养的明显提高。这种修复称作潜在致死性损伤修复。DNA辐射损伤的修复•1964年Setlow和Carrier首次从分子水平揭示DNA的辐射损伤修复。•除了辐射损伤以外，许多物理和化学因子都能造成DNA损伤，并引起修复，即使在没有外来损伤的条件下，生物体内对自发损伤或复制错误也不断地进行修复。DNA辐射损伤的修复•然而，在生物界所发现的能够在损伤后进行修复的生物分子为数很少。•除了氨基酰tRNA及细菌的肽聚糖外，能进行修复的生物大分子只有DNA。无疑．这与DNA在生命过程中的重要功能是分不开的。•研究DNA修复将有助于深刻地理解生物在保存和传递遗传信息中维持稳定性的机制，了解突变与进化的分子过程。DNA辐射损伤的修复•在放射生物学领域，对DNA修复的研究是一个重要的基础问题，理论上的阐明将有助于放射医学家和放射生物学家改进辐射损伤的防治，提高肿瘤的放疗效果，并且在探讨辐射致突与致癌机制方面有重要意义。DNA辐射损伤的修复DNA损伤修复的不同类型•DNA单链断裂的修复•DNA双链断裂的修复•碱基损伤的修复•DNA修复合成DNA的损伤修复机制•一种类型的DNA损伤可涉及多种修复途径，一种修复途径也可用于处理多种类型的DNA损伤。•在研究损伤修复机制时，多采用紫外线损伤模型，主要是由于紫外线造成的损伤类型比较单一，容易分析。•电离辐射损伤的修复在许多方面与之相似，但也有不同之处，应注意分辨。DNA的损伤修复机制•回复修复•切除修复excisionrepair•重组修复Recombinationrepair•SOS修复•错配修复MismatchrepairDNA单链断裂的修复•绝大多数正常细胞都能修复单链断裂。•例：用γ射线照射中国仓鼠卵巢细胞，保温不同时间后测DNA单链断裂修复的程度。DNA单链断裂的修复•多数实验结果证明，DNA修复与时间呈指数关系，修复速度依赖于温度。•半修复期大致为10~40min，因细胞类型和温度而异。•一般1h内DNA重接可达90%左右。DNA双链断裂的修复•资料证明，哺乳动物细胞大多数都能进行此种修复，但需要适宜的代谢条件和时间。•有人报道中国仓鼠卵巢细胞和小鼠骨髓细胞受γ射线照射后的双链断裂修复。•用中性洗脱法显示，在γ射线100Gy照射后，保温30min，膜上DNA残