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基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用TheCurrentStatusofGeneKnockoutanditsApplicationinMetabolicEngineering天津大学化工学院二零壹六年六月摘要基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9ABSTRACTGeneKnockoutisanimportantmolecularbiotechnologywhichhasdevelopedsine1980.Ithasbeenprovedefficientinmicrobialmetabolicengineering,transformofnimalsandplantsandfunctionalgenomics.Inthisreview,wemainlyintroducedthestrategiesofgeneknockoutanditsapplicationinmetabolicengineering.AndfournewstrategiesRNAi,ZFN,TALENsandCRISPR/Cas9werehighlightedindetail.Atlast,developingfrontiersandapplicationprospectsofgeneknockoutwerefurtherdiscussed.KEYWORDS：geneknockout,metabolicengineering,homologousrecombination,CRISPR/Cas9目录第一章基因敲除技术...........................................................................................11.1基因敲除相关背景...................................................................................11.2基因敲除技术在代谢工程中的应用.......................................................2第二章基因敲除策略...........................................................................................32.1传统的基因敲除策略...............................................................................32.1.1利用同源重组进行基因敲除........................................................32.1.2利用随机插入突变进行基因敲除................................................42.2新兴的基因敲除策略...............................................................................52.2.1利用RNA干扰引起的基因敲除................................................52.2.2锌指核酸酶基因打靶技术...........................................................52.2.3TALENs靶向基因敲除技术.......................................................62.2.4CRISPR/CAS9基因敲除技术......................................................7第三章前景展望...................................................................................................9参考文献...............................................................................................................10致谢.......................................................................................................................11第一章基因敲除技术1第一章基因敲除技术1.1基因敲除相关背景随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。现阶段基因功能的研究主要是通过减弱或中止某一基因表达，观察生物体整体功能变化，推测该基因的相关功能，然后将基因与生物整体功能相关联进行深入探究，为最终确定基因功能提供依据[1]。随着功能基因组学研究的深入，相关技术也得到不断地发展与完善，其中最为常用的便是基因敲除技术。基因敲除是20世纪80年代末发展起来的一门新技术，2007年获得诺贝尔生理或医学奖[1]。该技术是以DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础，经过30余年的发展，现今已经有多种基因敲除技术被应用于分子生物学、遗传学等诸多领域[2]。而近年来新兴起了ZFNs、TALENS、Cas9等多种基因高效靶向修饰和调控技术。2012年1月基因组编辑核酸酶技术的NatureMethods杂志评选为年度研究方法[3]。2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一[4]。这些技术极大地提高了基因敲除的效率，且具有极高的特异性，为研究基因功能创造了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展。基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除[5]。现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用最为广泛。基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。然而，基因敲除也有其无法克服的缺点和不足：1）在敲除过程中，被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区，残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能，这将给表型分析带来麻烦；2）敲除掉某个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因在于许多基因在功能上是冗余的，敲除掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其它成员可以提供同样的功能；3）对于某些必需基因，敲除后会造成细胞死亡，也就无法研究这些必需基因的功能；4）实验费用偏高，同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除，获得的表型差异很大[6]。第一章基因敲除技术21.2基因敲除技术在代谢工程中的应用具体而言，代谢工程是利用基因工程技术或其他物理、化学方法对细胞的代谢途径进行精确地修饰与改造，对细胞内目标物质的代谢流进行扩展、减小、阻断或构建新的代谢途径，从而有目的、有理性地改变微生物原有代谢特性，改进或者构建新的微生物表型，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，提高目的代谢产物活性或产量、或合成新的代谢产物的工程技术科学[7]。代谢工程的难题就是如何使微生物的代谢主流流经理想载流途径。在发酵生产中,为了达到这一目的，从营养物质进入细胞到产物产生通常需要从三个方面加以控制[8]，即：a.使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；b.阻塞或去除与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；c.消除或削弱目的产物进一步代谢的途径。在上述各过程中，起关键作用的无疑是酶，而基因敲除技术的出现使快速失活成为现实，从而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。通过基因敲除技术，可研究被敲除基因的生物学功能，还可以进行功能基因的插入及染色体基因的替换，进而可以阻断微生物细胞的代谢旁路，减弱毒/副作用，强化目标产物的产量或质量，降低能耗，从而成为具有重要工业应用价值的微生物细胞工厂研究中的重要内容[9]。第二章基因敲除策略3第二章基因敲除策略以下本文将通过两个方面讲述基因敲除技术，一是传统的基因敲除策略；二是新兴的基因敲除策略。并对这些策略做一些简单介绍以及概括。2.1传统的基因敲除策略2.1.1利用同源重组进行基因敲除经典的基因敲除策略是利用上述同源重组基本原理，通过体外改造一定长度/形式的基因，与细胞染色体上的靶基因发生同源重组(插入或置换)，从而改变细胞的遗传特性。从同源重组的基本原理出发，分别针对同源重组的底物类型(单链/双链、线性/环状)、重要蛋白(RecA酶、RecBCD酶等及噬菌体中具有相似功能的酶)和功能位点(Chi位点)等进行分子设计，即可开发出各种不同的基因敲除方法，根据同源重组载体的不同，可以把基因敲除方法分为线性单链DNA(ssDNA)、线性双链DNA(dsDNA)以及环状双链DNA(质粒载体)等3类：1.线性单链DNA敲除策略不但打靶载体易于构建，且其重组效率是双链DNA的10~100倍[10]；2.采用线性双链DNA进行同源重组，是近年来基因敲除方法的热点之一。其优点是可以避免较为繁琐的基因克隆和质粒载体构建步骤，而直接采用PCR方法扩增获得目标同源重组片段。然而，线性双链DNA易于被细胞内的RecBCD酶降解，为了解决上述问题，可以在线性双链DNA的两侧引入Chi位点，保护DNA不被RecBCD酶降解，并能强化RecBCD酶介导的同源重组效率[11]。3.构建环状质粒载体进行目标基因敲除的方法，是实现微生物基因敲除的经典策略，主要通过微生物本身的RecA重组系统(主要包括RecA和RecBCD等蛋白)发挥作用。RecA蛋白是单链结合蛋白，促进各类DNA分子间的同源联会、配对、链交换和分支迁移RecBCD是由RecB、RecC和RecD三个蛋白组成的复合体，它能与双链切口结合使DNA链解开，并在Chi位点形成单链，然后由RecA蛋白促进同源重组。由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性，所以线性DNA分子第二章基因敲除策略4在细菌体内会被降解。因此，必须通过环状质粒载体克隆来完成同源重组片段的分子设计和构建[9]。常用的环状质粒载体敲除策略有4种[12]：a.非复制型质粒载体敲除法对野生菌做基因敲除，可以先考虑用非复制型载体。由于构建好的敲除载体在受体菌中是不复制的，因此转化之后，在选择压力下，未发生重组的转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被稀释。b.不稳定型质粒载体敲除法若受体菌感受态较难制备，可考虑采用不稳定型敲除载体。这种质粒在受体菌中分配不稳定,在无压力选择或低磷条件下培养5～10代会出现很多质粒丢失的细胞。因此转化后可先控制培养条件使敲除载体随细胞复制以增加转化子的数目，然后再在无压力选择或低磷条件下让质粒丢失，最后在选择压力下筛选敲除子。c.温度敏感型(Ts型)质粒载体敲除法1993年，Biswas等[13]利用Ts型质粒建立了革兰氏阳性菌高效的基因敲除系统。Biswas所用质粒pG+host5在37℃时不复制，而28℃时以滚环模式进行复制。因此转化后在选择压力下37℃培养会导致第一次同源重组sco(si