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Neuregulin-1/ErbB通路在脐带血间充质干细胞分化为雪旺氏样细胞中的作用开题报告报告人：成艺坪、吕兆睿2014年12月研究现状雪旺氏细胞：1、在周围神经再生中起重要作用：对再生轴突起引导作用，并可诱导生长锥的迁移方向。2、分泌多种神经营养因子(Neurotrophinfactors)：营养、支持神经细胞的增殖代谢和调控轴突的再生与髓鞘的形成。雪旺氏细胞移植：已有报道表明，神经缺损处的雪旺式细胞能促进神经再生、跨越神经缺损处抵达相应的靶细胞，并实现部分的功能恢复。现状：雪旺氏细胞来源困难，而且体外增殖缓慢，难以真正进入实际的临床应用。因此，近年来，有关具有多向分化潜能的干细胞尤其是成体干细胞作为供体细胞进行细胞移植治疗的研究日益受到重视，而其中有关间充质干细胞（Mesenchymalstromalcells,MSCs）的研究更是热点。研究现状MSCs：是来自于唯一来源于同一原始胚层的成体多能干细胞，可以在特定的条件下诱导分化成为中胚层来源的心肌细胞、软骨细胞以及外胚层来源的神经细胞（神经元和胶质细胞）。特点：MSCs可以自体取材，并具有理想的体外扩增速度，因而有望成为雪旺氏细胞移植治疗的替代细胞。为进行干细胞移植修复神经损伤提供了一种独特的解决方案。现状：1、MSCs分化为胶质细胞样或神经元样细胞已多见报道。国内外多个研究小组成功地使MSCS分化为雪旺氏样细胞，并且有研究者将分化或未分化的MSCs细胞应用于损伤神经的修复，也获得了较好的功能恢复。2、体外诱导MSCs细胞分化的技术已较成熟，主要通过维甲酸和巯基乙醇的预诱导后，在综合应用各种细胞因子、肽类物质等实现分化，产生S-100、GFAP等阳性的雪旺氏样细胞。研究现状MSC如何被诱导分化为雪旺氏样细胞？目前的观点认为干细胞在其分化的过程中自身所处的微环境对其最终的分化命运起着至关重要的作用，即外来信号能指导干细胞沿着特异性的路线向某一谱系分化或增加干细胞选择某一谱系的机会。例证：神经嵴（neuralcrest）细胞在体内向雪旺氏细胞的分化。神经嵴是一种多能性的细胞，在不同的环境下可以分化为肌肉细胞、软骨细胞、神经元、神经胶质细胞等。其中决定胶质细胞走向的一个重要因子是Neuregulin-1，Neuregulin-1在早期发育的神经元表达，而雪旺氏前体细胞能够表达相应的受体ErbB2等，并通过Neuregulin-1/ErbB信号通路维持雪旺氏细胞前体的存活，促进雪旺氏前体细胞的成熟与分化。研究现状骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：1.随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；2.制备过程不容易质控；3.移植给异体可能引起免疫反应；4.取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。脐带血间充质干细胞优点：1.保持了间充质干细胞的生物学特性2.胎盘和脐带中的干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。3.免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。4.干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。5.采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤。6.采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。研究现状MSC如何被诱导分化为雪旺氏样细胞？目前的观点认为干细胞在其分化的过程中自身所处的微环境对其最终的分化命运起着至关重要的作用，即外来信号能指导干细胞沿着特异性的路线向某一谱系分化或增加干细胞选择某一谱系的机会。例证：神经嵴（neuralcrest）细胞在体内向雪旺氏细胞的分化。神经嵴是一种多能性的细胞，在不同的环境下可以分化为肌肉细胞、软骨细胞、神经元、神经胶质细胞等。其中决定胶质细胞走向的一个重要因子是Neuregulin-1，Neuregulin-1在早期发育的神经元表达，而雪旺氏前体细胞能够表达相应的受体ErbB2等，并通过Neuregulin-1/ErbB信号通路维持雪旺氏细胞前体的存活，促进雪旺氏前体细胞的成熟与分化。研究现状Neuregulin-1：属于表皮生长因子EGF家族的成员，能够和相应的受体相结合并激活受体的酪氨酸激酶活性，产生相应的生物学效应。在心血管系统、神经系统的发育过程中起着重要的作用。Neuregulin-1基因有多种剪接体，包括Ⅰ型的ARIA(acetylcholinereceptorinducingfactor)，Ⅱ的胶质细胞生长因子（gialgrowthfactor,GGF）以及Ⅲ型的感觉运动衍生因子（sensoryandmotorderivedfactor,SMDF），它们都含有EGF样的基序，但是N端的氨基酸序列有所差异，在不同的组织中各剪接体的表达及功能有所差异。Neuregulin-1的受体：主要包括ErbB2和ErbB3，Neuregulin-1通过结合ErbB2和ErbB3的异二聚体激活下游通路产生相应的生物学效应。研究现状Neuregulin-1/ErbB在雪旺氏细胞分化过程中的主要作用提示我们，是否Neuregulin-1/ErbB也会在间充质干细胞向雪旺氏样细胞的分化过程中起作用？1、Dezawa等的研究表明，在体外培养的间充质干细胞中用Neuregulin-1和其他因子诱导能够使MSCS分化为S-100阳性的雪旺氏样细胞。2、前期的实验用RT-PCR方法检测到ErbB2在间充质干细胞中的表达。这些都提示Neuregulin-1/ErbB是影响间充质干细胞向雪旺氏样细胞分化的重要因素。因此本课题拟从Neuregulin-1/ErbB入手，探讨其在间充质干细胞向雪旺氏样细胞分化过程中的生物学作用。课题思路1、利用间充质干细胞的体外诱导模型，检测分化过程中Neuregulin-1及其受体、雪旺氏细胞相关标记蛋白的表达变化。2、对体外分化细胞的功能进行检验：用分化的雪旺氏样细胞与背根神经节共培养，研究分化的雪旺氏样细胞对背根神经节的生物学效应。3、通过阻断Neuregulin-1/ErbB的途径，观察相应的分化过程以及分化细胞的功能所受到的影响。4、PI3K/Akt信号转导通路的检测。通过上述实验，揭示Neuregulin-1/ErbB在间充质干细胞向雪旺氏样细胞的分化过程的作用。实验方法HUCBMSCs细胞培养与鉴定HUCBMSCs的诱导分化和鉴定相关实验的预期结果HUCBMSCs细胞培养与鉴定1.脐带血间充质干细胞复苏。2.重悬细胞，以1．0×108／ml浓度接种于培养瓶。置于37℃、体积分数5%CO2孵箱中培养。（胚胎干细胞培养基：低糖DMEM+体积分数10%胎血清+1%双抗）3.7d后第1次换液，弃掉未贴壁细胞，以后每3d换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况。4.待原代培养细胞长到80％融合后，用0．25％的胰酶(GIBCO公司，美国)按1：3传代培养。5.取第1次传代所得细胞，用0．25％的胰酶消化贴壁的细胞，离心洗涤，PBS重悬细胞，并调整细胞浓度为1×106个/ml。6.取1ml细胞悬浊液加入分别10uI鼠抗人CD34一PE(HumanMiltenyibiotec公司，美国)、鼠抗人CD45一PE(HumanMihenyibiotec公司，美国)、鼠抗人CD90一PE(BDPharmingen公司，美国)、鼠抗人SI-12一FITC(AbDSerotec公司，美国)单克隆抗体混匀，避光放置20min后，离心洗涤两次，300ulPBS重悬细胞，流式细胞仪(FACSCalibur，BDBiosicence公司，美国)检测。HUCBMSCs细胞培养与鉴定HUCBMSCs的诱导分化和鉴定1.取第3次传代所得细胞。2.用含10％FBS的L—DMEM调整细胞悬液浓度为6×104～8×104／ml，接种在放有盖玻片作为细胞爬片的六孔培养板中.3.细胞80％融合时，传代，随机分为实验组和对照组。诱导方法：1、按0.25mmol/mlβ-巯基乙醇(p—,mercaptoethanol，B—ME，Sigma公司，美国)、20ng/ml全反式维甲酸(retinoicacid，RA，Sigma公司，美国)、2．5uml／mlForskolin(Alexis公司，美国)、5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(b．FGF，PeproTech公司，美国)、20ng/ml血小板衍生生长因子(PDGF，Pep—roTech公司，美国)，100ng／mlHRG(RnD公司，美国)的浓度比例加入含10％FBS的LDMEM制成诱导液，加入六孔板。2、第2天后换用含10％FBS的L-DMEM培养1天3、第3天换用诱导液培养1天4、第4、5天用含10％FBS的L—DMEM培养5、第6、7天最后换用含10％FBS的L—DMEM培养在倒置显微镜下每日观察。诱导7d后，实验组细胞可能有少量死亡。细胞爬片用GFAP抗体做免疫组化染色.HUCBMSCs的诱导分化和鉴定分组情况：1.实验组：正常诱导2.对照组1：不加诱导剂的含10％FBS的L—DMEM培养细胞3.对照组2：诱导培养期间在分化培养基中加入神经调节蛋白-1、ErbB受体抑制剂AG1478,1umol/ml进行干预。4.对照组3：诱导培养期间在分化培养基中加入PI3K抑制剂Wortmannin,1umol/ml进行干预。各组检测雪旺式细胞存在与否：方法一：7d后，实验组和对照组的细胞爬片,用鼠抗人GFAP单克隆抗体(Sigma公司，美国)，免疫组化SP-9000试剂盒、浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，按HE染色和S—P法进行GFAP免疫组织化学染色。在光学显微镜下观察细胞胞浆内是否有棕黄色颗粒，有棕黄色颗粒的细胞为免疫组化阳性，10×20倍视野下随机计数lO个视野细胞数，计算出阳性细胞的百分率。采用SPSS12．0软件进行统计学分析。方法二：7d后，实验组和对照组流式细胞仪分别检测雪旺式细胞的标志性蛋白表达情况。采用SPSS12．0软件进行统计学分析。方法三：PCR检测下游通路的重要蛋白质、或RNA等。具体还没有弄清，打算寒假完成。若检测雪旺式细胞的存在与否不足以说明神经调节蛋白-1、ErbB受体，PI3K/Akt信号转导通路的作用，则需进一步添加神经调节蛋白-1、ErbB受体，PI3K/Akt信号转导通路中关键蛋白的的检测。HUCBMSCs的诱导分化和鉴定预期结果-培养结果1、原代培养：细胞接种2d后，出现少许贴壁细胞，并逐渐伸出突起。4-7d后出现大量的贴壁细胞，呈圆形或短梭形。14d后细胞形态向长梭形转变。21d左右，梭形细胞融合成单层，长满整个培养瓶。2、传至第3代后，细胞扩增明显减慢，形态为成纤维样细胞和略宽大扁平形细胞，形态上类似于BMMSCs，再次传代培养，14d左右可达到融合。预期鉴定结果：流式细胞仪检测，显示细胞高表达表面抗原CD90和SH2，阳性较高；低表达表面抗原CD34和CD45，阳性率较低。预期结果-诱导结果1、诱导7d后，实验组细胞有少量死亡。2、方法一检测的预测结果：两组细胞爬片用GFAP抗体、s-100抗体做免疫组化染色.实验组：细胞免疫组化染色阳性，胞浆中有棕黄色颗粒，诱导后的细胞外观上均似梭形，呈2—3个突起，外观上更具雪旺细胞(sehwanncell，sc)长梭形形态。对照组1：细胞免疫组化染色阴性，胞浆呈蓝色。对照组2：细胞免疫组化染色阴性，胞浆呈蓝色.对照组3：细胞免疫组化染色阴性，或者阳性率极低。3、方法二检测的预测结果：实验组：流式细胞仪检测，神经调节蛋白-1、ErbB，S-100、p75、GFAP,阳性。对照组1,2,3：阴性。机制探讨神经调节蛋白-1通过与表皮生长因子样受体(EGF-likereceptor，ErbB)结合，引起ErbB受体酪氨酸磷酸化，进而激活下游信号通路，在细胞分化、增殖过程中起重要作用。而下游通路中，磷脂酰肌醇-3-激酶/磷酸化蛋白激酶B信号通路可能是主要通路之一。本实验用来验证，此通路是否在人脐带血间充质干细胞分化为雪旺式细胞过程中起主要作用。机制探讨