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1酶工程EnzymeEngineering2主要参考书陈守文主编.酶工程.科学出版社,2008.徐凤彩主编.酶工程.中国农业出版社，2005.王镜岩主编.生物化学(第三版).北京:高等教育出版社,2002.张树政,孟广震,何忠效主编.酶学研究技术(上册).北京:科学出版社,1987许根俊编著.酶的作用原理.北京:科学出版社,1983.袁勤生主编.现代酶学.上海:华东理工大学出版社,2001.陈石根,周润琦编著.酶学.上海:复旦大学出版社,2001.罗贵民主编.酶工程.北京:化学工业出版社,2002.邹承鲁,周筠梅,周海梦.酶活性部位的柔性.济南:山东科技出版社,20043教学目的和要求酶工程是新兴的生物技术领域，涉及多种学科知识，包含内容十分广泛。本课程重点讲授酶工程的基础知识，主要内容包括酶的作用基本原理、酶的生产、酶的分离纯化技术、酶的生物改造、固定化酶及酶反应器和传感器等。通过本课程的学习，希望学生能掌握酶工程的基础知识和主要方法，并对其应用前景有所了解，为从事相关研究打好基础。4预修课程：生物化学、分子生物学学时：36；学分：2上课方式：讲授为主，讨论为辅勤于思考，勇于发言考试时间：待定考试方式：闭卷ParticipateandEnjoyit!!5酶工程概念酶工程研究的内容酶工程研究的意义酶工程研究的进展及应用第一章绪论6酶是什么？酶是由细胞产生的具有催化能力的生物催化剂。位置：胞内，胞外之分第一节酶工程是生物技术的重要组成部分重要性：维持生命活动的正常运转。酶是促进一切代谢反应的物质，没有酶，代谢就会停止，生命也即停止。新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生！酶的研究深刻影响生物化学及整个生物学领域，也刺激了化学研究。研究意义：1、研究酶的理化性质及其作用机理，对于阐明生命现象的本质有着重要意义；2、酶是分子生物学研究的重要工具（核酸一级结构测定的突破）。生物学化学工程工程学化学生物工程生物化学生物技术7生物技术（Biotechnology），又称生物工程，是20世纪70年代发展起来的一门新的综合性技术学科。应用：人工胰岛素、干扰素、SARS病毒抗体、H1N1抗体等生物技术概念生物技术的发展，极大促进了工农业生产的根本变革，对人类生产和生活影响深远。各国正大力开展生物技术研究。生物技术：综合性地运用生物学、化学和工程学（化工、计算机等）技术，改造物种、创造新物种，分离和改造生物体中的某些组分（如酶、蛋白、核酸、细胞器），利用生物体的某些特殊机能（如酶的催化功能、抗体的免疫功能等），为工农业生产及医疗卫生服务。8生物工程的分科基因工程细胞工程酶工程发酵工程（生物工程）（生物技术）（微生物工程）四者相互依存，相互促进酶工程是生物工程的重要组成部分9酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程的关系基因工程基因工程菌发酵工程酶酶工程转基因动物转基因植物菌体细胞细胞固定化菌体细胞细胞工程酶酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程有密切的联系，尤其与发酵工程的联系更加紧密。10第二节酶工程的内容酶工程（EnzymeEngineering）：又叫酶技术。是从应用的目的出发，将酶学理论与化学工程相结合而产生的，在一定反应装置中利用酶的特性，将原料转化为产物而形成的一门新技术；也是酶制剂的生产和应用的技术。其内容如下：1、酶的产生（发酵）（微生物、动植物）为什么固定？中心任务!热门话题！核心!4、酶分子改造（酶分子修饰，两方面：基因工程或蛋白质工程技术改造基因和结构；化学法或酶法改造酶蛋白一级结构或修饰侧链基团）日常生活中很多酶来源于微生物，如：啤酒酵母、面包酵母和酸乳用菌等。此部分内容：优良菌株选育、构建基因工程菌、优化发酵条件等，研究、开发生产具有特殊性能的新酶等。2、酶的分离制备（酶制剂的活性、纯度、收率、成本）3、酶和细胞固定化不同的需求要求酶的量和纯度都不一样。根据使用目的纯化酶，并考虑活性、收率和成本，需要合理的分离提纯技术和手段做支撑。分离提纯技术是当前生物技术“后处理工艺”的核心所在。A，重复利用，提高效率；B，固定化有可能提高稳定性；C，产品回收便利。如：固定化葡萄糖异构酶、固定化氨基酰化酶等。固定化技术是酶技术现代化的一个重要里程碑，是克服天然酶在工业应用方面的不足，发挥酶反应特点的突破性技术。没有固定化技术的开发，就没有现代的酶技术。5、人工酶(模拟酶)和抗体酶（高催化能力且具备酶所没有的优点；有助于了解酶的作用机制。抗体酶：具备催化活性的抗体）6、酶传感器（酶电极；其种类、结构与原理、制备、性质和应用）8、酶技术的应用（发现数万种，应用只有数十种；应用广泛）7、酶反应器（其类型、特性及设计、制造等）第三节酶和酶工程研究的重要意义•生产重要价值的产品(Arginase抗癌，青霉素酰化酶合成抗生素)；•改进生产工艺、提高产量和产率，降低成本；（洗衣粉加入碱性/低温的蛋白酶，饲料用酶，果胶酶处理果汁）•医疗、环保(天门冬酰胺酶治疗白血病，尿酸酶uricase治疗痛风)。1、生命依赖新陈代谢，新陈代谢离不开酶；如：苯丙氨酸羟化酶缺乏→血液中Phe过量，影响大脑发育；Etd存在，Ald缺失→乙醛过多，毛细血管扩张→脸红）2、了解酶的催化机制;催化剂、药物的设计，疾病诊断，酶的抑制剂---抗生素3、工具酶。如：TaqDNAPolymerase，T4DNAligase为什么要研究酶和酶工程？酶的研究不仅影响生物化学和生物学领域，而且刺激了许多化学研究，成为灵感的源泉。目前应用广泛：1213第四节酶和酶工程研究进展1833年，Payen和Persoz发现了第一个酶--淀粉酶:麦芽的水抽提物酒精沉淀后获得；1835年，Berzelius明确提出了催化作用的概念；1878年，库尼对酶命名：Enzyme（希腊文“在酵母中”）1896年，德国Buchner兄弟从酵母的无细胞抽提液中发现了将葡萄糖转化为乙醇的酶。（里程碑式）对酶的认识：4000年前，酿酒；3000年前，降解麦芽糖制造饴糖酿酒：淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶、蔗糖水解酶及酒化酶（磷酸化酶、醛缩酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖6-磷酸酶等）共同作用的结果；酒曲：（富含淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，维生素）治疗消化障碍症。1913年，Michaelis-Menten提出了酶促反应动力学原理--米氏方程：酶由定性到定量以及作用机制的探讨1963年，测出了胰凝乳蛋白酶（245AA）的一级结构；1965年，阐明了鸡卵清溶菌酶（129AA）的三维结构；1969年，人工化学合成了第一个RNA酶（牛胰核糖核酸酶）促进了酶的分离纯化及对其理化性质的探讨，促进了对有关生命过程中酶系统的研究。里程碑式的发现，酶学研究始于此。两个方向发展：应用；理论已发现存在近25000种，1500种纯化至均一，数百种结晶。有些代谢用酶认识清楚，但有关遗传过程的酶还有待深入研究。酵素14对于酶的化学本质的认识最早：Willstattar认为，酶不一定是蛋白质，而是一种胶质；1926年，脲酶结晶(Summer,洋刀豆,第一个)→酶的本身是蛋白质--1947年诺奖；1982年，Cech→自我剪接功能(Ribozyme;四膜虫细胞内26SrRNA)；1994年以来，人工合成的具有特异切割RNA或DNA的DNA分子，称为脱氧核酶（DNAzyme）。酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质、RNA或DNA）。15一、酶的应用研究进展A，酶的分离、提纯，酶制剂的应用1926年，Summer从刀豆制备脲酶结晶。淀粉酶、糖化酶、果胶酶、凝乳酶、脂肪酶、各种蛋白酶实现了商品化，应用于食品加工-发酵工业、制革工业、纺织、医疗卫生、环保、能源开发等。酶的研究历程：应用和理论方面B，固定化酶、固定化细胞1953年，Crubhofer,Schleith研究酶的固定化，胃蛋白酶、淀粉酶、羧肽酶、核糖核酸酶固定于重氮化的树脂上。1969年，日本千畑一郎首次应用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基酸获得成功；1973年，日本千畑一郎利用固定化大肠杆菌生产L-天冬氨酸。一种酶固定化死菌→固定多酶活菌→固定化工程菌（生物炼制）80年代起，研究固定化动物、植物细胞，大多数还处于研究阶段（困难，但可获得贵重药品—人参皂苷、乙肝病毒表面抗原、单克隆抗体；处于实验阶段）。C，酶电极--1967年：葡萄糖氧化酶电极测葡萄糖浓度；胆碱酯酶电极测胆固醇含量；脲酸酶电极测尿酸含量。D，60年代，发展起了酶标免疫测定技术。酶标抗原或抗体→免疫反应→酶-抗体-抗原复合物→测定抗原或抗体的量E，抗体酶、人工酶、模拟酶的探索和发展。16抗体酶（CatalyticAntibodies）Abzyme将抗体的高度选择性与酶的高效催化能力巧妙结合的产物。抗体酶是一种具有催化功能的抗体分子，在其高可变区赋予了酶的属性。利用可卡因降解的过渡态类似物磷酸单酯产生单克隆抗体催化可卡因降解。17人工酶ArtificialEnzyme人工合成的具有催化活性的蛋白质或多肽；1977年，人工合成的Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe八肽，具有天然溶菌酶50%的活力。1990年，使用酪氨酸乙酯作为胰凝乳蛋白酶的底物，用计算机模拟胰凝乳蛋白酶的活性部位，构建出一种由73个氨基酸残基组成的多肽，其活性部位由His、Asp、Ser组成。此多肽对烷基酯的水解活力为天然酶的1%，具备底物专一性以及对胰凝乳蛋白酶抑制剂的敏感性。18模拟酶利用有机化学合成方法合成一些比酶结构简单得多的具有催化功能的非蛋白质分子。这些物质分子可以模拟酶对底物的结合和催化过程，既可以达到酶催化的高效率，又可以克服酶的不稳定性，这样的物质分子被称为模拟酶。（2007年中科院物理研究所阎锡蕴博士发现氧化铁纳米颗粒具有过氧化物酶的催化活性—氧化铁纳米颗粒模拟酶《自然-纳米技术》）酶的模拟分三个层次：合成具有类似酶活力的简单络合物；酶活性部位模拟；整体模拟。19克隆酶和突变酶用基因工程技术生产的酶，称为克隆酶。用基因定位突变技术修饰天然酶基因，然后用基因工程技术生产该突变基因的酶。突变酶是目前工业酶的主要来源。201.新酶的发现和鉴定已经发现的酶25000种，数千种已被鉴定。2.酶一级结构与活力关系的研究新技术过渡态类似物技术自杀性底物技术基因定位突变技术计算机模拟技术3.酶分子高级结构测定核磁共振NMR、X-射线衍射数百种已得到结晶，数百种测定了一级结构二、酶的理论研究进展酶的研究历程：理论方面211）应用X-射线衍射法研究结晶态酶-底物复合物结构，确定酶活性部位结构以及酶分子与底物分子结合的情况；2）应用二维核磁共振技术可以测定酶活性部位上解离基团的pK值，以及催化过程中质子转移的情况；3）应用隧道电镜技术可以观察催化过程中质子和电子转移的情况；4）酶作用的动力学研究，利用计算机编制程序，对ES作用方式和可能存在的酶分子各种形式做出判断；5）应用同位素交换技术，可以解决一般方法不能解决的问题（同位素法测定胆碱酯酶催化活性，在乙酰胆碱的乙酸部位以14C或3H标记，测定乙酸的量）。4.酶活性部位与催化机理研究225.Ribozyme的发现核酶：生物体中的一些RNA和DNA也具有催化作用，具有酶的类似性质，称为Ribozyme。核酶的发现，对于生命起源、生物进化的研究，对于基因、病毒、肿瘤的治疗，具有重大意义。它们也是生物催化剂，能切割特异性RNA序列的RNA分子。231982年，Cech在研究四膜虫(Tetrahymena)细胞内26SrRNA（核糖体核糖核酸）前体时，发现在没有任何蛋白质存在的情况下，具有自我剪接功能（Self-splicing），将这种具有催化活性的RNA称为ribozyme。这个发现使得他成为第一个展示具有催化能力的RNA，目前已经发现了数百个RNA酶（核酶）。USAUniversityofColoradoBoulder,CO,USA1947-24四膜虫r-RNA前体自我剪接反应内含子（424bp,间隔序列)(interveningseque