电泳分离法

电化学分离方法张宇概述电化学分离法的定义：基于原子或分子的电性质以及离子的带电性质和行为进行化学分离的方法。电化学分离的特点：􀂾操作简单，往往可同时进行多种试样的分离；􀂾除消耗一定电能外，化学试剂消耗少，放射性污物少；􀂾分离速度比较快（除自发电沉积和电渗析），尤其高压电泳，即使复杂样品也能快速分离。21自发电沉积2电解分离法3电泳分离法4电渗析分离法5化学修饰电极分离富集法6溶出伏安法3电泳分离方法一、电泳分离法的发展和特点前言1937年，瑞典科学家蒂塞利乌斯设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。6电泳•定义1：•液体介质中带电的胶体微粒在外电场作用下相对液体的迁移现象。•定义2：•依据分子或颗粒所带的电荷、形状和大小等不同，因而在电场介质中移动的速度不同，从而达到分离的技术。•定义3：•带电物质或细胞在电场中的泳动。根据大分子或颗粒的电荷、大小和形状不同，使其在通过电场中的凝胶或介质时发生分离的方法。7简单定义：电泳•带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis,EP)。•利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。•1937年瑞典学者A.W.K.提塞留斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。8ArneWilhelmKaurinTiselius阿恩·威廉·考林·提塞留斯提塞留斯是瑞典著名生化学家和物理化学家。1902年8月10日出生在斯德哥尔摩，在乌普沙拉大学获三个硕士和一个博士学位，毕业后留校任教。他改进、设计了电泳仪，成功地分离了血清中的蛋白质，对氨基酸和肽也作了分离研究，改进了色层分离法，他设计的电泳仪至今还在应用，发展了生物化学的研究手段，荣获1948年诺贝尔化学奖。他还多年担任诺贝尔基金评审的委员，副会长和会长之职。1971年10月29日因心脏病突发而卒于家中，终年69岁。电泳特点•在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为常数，是该带电粒子的物化特征性常数。•不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。10电荷移动规律•利用电泳可以确定胶体微粒的电性质，向阳极移动的胶粒带负电荷，向阴极移动的胶粒带正电荷。•一般来讲，金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸附阳离子，带正电荷；•非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子，带负电荷。•因此，在电泳实验中，氢氧化铁胶体微粒向阴极移动，三硫化二砷胶体微粒向阳极移动。利用电泳可以分离带不同电荷的溶胶。11应用领域•1809年俄国物理学家Peнce首先发现了电泳现象，但直到1937年瑞典的蒂塞利乌斯建立了分离蛋白质的界面电泳（boundaryelectrophoresis）之后，电泳技术才开始应用。•本世纪60-70年代，当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电泳以来，电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式使其应用十分广泛。电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。由于某些电泳法设备简单，操作方便，具有高分辨率及选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。12电泳种类I：•移动界面电泳•是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。13电泳种类II：•区带电泳•是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳等。14•等电聚焦电泳•是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。15电泳种类III：区带电泳1•按支持物的物理性状不同,区带电泳可分为:•(1)滤纸为支持物的纸电泳;•(2)粉末电泳:如纤维素粉,淀粉,玻璃粉电泳;•(3)凝胶电泳:如琼脂,琼脂糖,硅胶,淀粉胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳;•(4)丝线电泳:如尼龙丝,人造丝电泳。16区带电泳2•按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为:(1)平板式电泳:支持物水平放置,是最常用的电泳方式;(2)垂直板电泳:聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳.(3)柱状(管状)电泳:聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳.17区带电泳3•按pH的连续性不同,区带电泳可分为:•(1)连续pH电泳:电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳,醋酸纤维素薄膜电泳;•(2)非连续pH电泳:缓冲液和支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳;18电泳分离原理19电泳是在电场作用下，电解质溶液中带电粒子向两极作定向移动的一种电迁移现象。电泳分离的依据是不同带电粒子迁移率的差别。与电迁移所不同的是，电泳通常需要一种多孔材料作电解质的支持体，以消除电解质的非定向运动所引起的电泳带变宽，便于取样测定，或获得分离后的组分。在电场强度为E的电场作用下带电荷Q的粒子的迁移率μ表示为：ν为带电粒子的运动速度；η为介质的黏度；r为带电粒子的半径。因此一定实验条件下，各种带电粒子的μ值是一个定值。根据离子迁移率的定义，还可以写成：V为外加电压；L为两电极间的距离；t为电泳的时间；s为带电质点在此时间内迁移的距离。设A、B两种带电粒子的迁移率分别为μA和μB，在电场作用下，经过时间t后，它们的迁移距离为：两种粒子迁移的距离差为：由上式可得，μA-μB、t、V/L三者的值愈大，Δs愈大，A、B两个粒子之间分离愈完全。20影响电泳的因素•1.电泳介质的pH值•溶液的pH值决定带电物质的解离程度,也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质,氨基酸等类似两性电解质,pH值离等电点越远,粒子所带电荷越多,泳动速度越快,反之越慢.因此,当分离某一种混合物时,应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值,以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定,必须采用缓冲溶液.21•2缓冲液的离子强度•低离子强度时,迁移率快,但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定.•高离子强度时,迁移率慢,但电泳谱带要比低离子强度时细窄.通常溶液的离子强度在0.01-0.1M之间.22影响电泳的因素•3.电场强度•电场强度(电势梯度Electricfieldintensity)是指每厘米的电位降(电位差或电位梯度).电场强度对电泳速度起着正比作用,电场强度越高,带电颗粒移动速度越快.影响电泳的因素•根据实验的需要,电泳可分为两种:一种是高压电泳,所用电压在500～1000V或更高.由于电压高,电泳时间短(有的样品需数分钟),适用于低分子化合物的分离,如氨基酸,无机离子等.因电压高,产热量大,必须装有冷却装置,否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离,还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多,使支持物(滤纸,薄膜或凝胶等)上离子强度增加,以及引起虹吸现象(电泳槽内液被吸到支持物上)等,都会影响物质的分离.另一种为常压电泳,产热量小,室温在10～25℃分离蛋白质标本是不被破坏的,无需冷却装置,一般分离时间长.24•4.电渗现象在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗.在有载的电泳中,影响电泳移动的一个重要因素是电渗.产生电渗现象的因是载体中常含有可电离的基团,如滤纸中含有羟基而带负电荷,与滤纸相接触的水溶液带正电荷,液体便向负极移动.由于电渗现象往往与电泳同时存在,所以带电粒子的移动距离也受电渗影响。25影响电泳的因素二、电泳分离法的类型和应用电泳分为前流型和区带型两种：􀂾前流型：无支持体的溶液自由进行的电泳；􀂾区带型：在支持体上进行的电泳，实际中应用更广。常用的支持体有纸、薄板、纤维素、毛细管等。1.铂电极；2.电解液；3.醋酸纤维和色层纸；4.带有孔或缝的铅板；5.玻璃板；6.G-M计数管；7.绝缘材料；8.密封滤纸的盖，以免水蒸发掉醋酸纤维素的倒转式电泳分离器27应用实例：纸上电泳分离金属􀂾电泳纸处理:色谱纸切成46.2×2cm,浸入0.025mol/L五氯化锑的4MHCl溶液中,取出,室温干燥。后浸入25mM硫酸铈铵溶液,取出滤纸吸干,离子水洗涤,除去过量硫酸铈铵溶液,室温干燥。􀂾分离测定：以0.1MHCl或0.1MHCl+0.1MNH4Cl(1+1)作背景电解质,滴入待分离试样溶液,在150V电压下，电泳4h，使Pd与Bi、Cu、Cd、Co、Ni、Au等分离，取出纸片，干燥，切出圆点面积，用10%HCl溶液（2×20mL）溶解，Pd被洗脱，用亚硝基二甲基苯胺作显色剂，分光光度法测定钯。28凝胶电泳分离DNA凝胶电泳是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10g的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆技术操作。29凝胶电泳琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。30凝胶电泳琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小2、琼脂糖浓度3、DNA分子的构象4、电源电压5、嵌入染料的存在6、离子强度影响31毛细管电泳(capillaryelectrophoresis)多种基于抗对流介质的电泳技术(如纸电泳，凝胶电泳等).传统的电泳技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低。80年代初,细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术—毛细管电泳，又称高效毛细管电泳(HPCE)。32高效毛细管电泳(HPCE)的原理和特点：原理-是指离子或带电粒子以毛细管为分离室,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术.由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大,易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是CE和传统电泳技术的根本区别。特点-高灵敏度,高分辨率,高速度,样品用量少,成本低,应用范围广。33毛细管液相色谱和毛细管电泳装置示意图34由于毛细管电泳具有高效、快速、样品量极少等特点，它广泛用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环境