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真菌基因工程三、甲醇酵母表达系统二、酵母转化系统一、真菌表达系统的优缺点四、丝状真菌表达系统一、真菌表达系统的优缺点具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点二、酵母转化系统酵母宿主系统酵母载体系统酵母系统标记基因酵母转化方法外源DNA在酵母宿主中的命运1、酵母宿主系统提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌用作外源基因表达的酵母宿主菌用作模式真核生物的酵母宿主菌用作模式真核生物的酵母宿主菌酿酒酵母（Saccharomycescereviasiae）：*无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物*繁殖方式与原核类似，易于操作*基因表达调控机理与高等真核类似用作外源基因表达的酵母宿主菌酿酒酵母：最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）汉逊酵母：多型汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）其它酵母：已有60多种酵母菌建立了转化系统乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis)非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型och外侧糖链添加缺陷型突变类型生物效应许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc2提高重组蛋白表达转录后加工rgr1提高重组蛋白表达转录水平ose1提高重组蛋白表达转录水平ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-提高重组蛋白表达转录水平突变类型生物效应作用位点减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aaubiquitinligaseE3LysubiquitinligaseE3Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI1编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI2编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI3编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关闭UBI4编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株能正常生长。UBI4缺陷型：UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效人工构建质粒:5种酵母附加型质粒（YEp）酵母复制型质粒（YRp）酵母着丝粒质粒（YCp)酵母人工染色体（YAC）酵母整合型质粒（YIp）野生型质粒：2m质粒（酿酒酵母）2、酵母载体系统酿酒酵母中的2μ环状质粒野生型，双链、环状、6kb拷贝数达50至100个同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRABIRs反向重复序列，600bp，重组FLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质粒类似。含有大肠杆菌质粒的复制元点，以便克隆操作含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点含有在酵母和大肠杆菌中进行选择的双标记除YIp型质粒外均为穿梭载体人工构建酵母质粒的共同特点YEp质粒*复制子：2m质粒来源的ori*拷贝数50-100*不稳定培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。YRp质粒*复制子：染色体来源的ARS*拷贝数50-100*不稳定培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。ARS:autoreplicationsequenceYCp质粒*在YRp中引入CENCEN：着丝粒序列，来源于3号染色体，有丝分裂稳定，低拷贝数*复制子：染色体来源的ARS*拷贝数：1-5YAC质粒*在YCp中引入TELTEL：端粒，染色体末端序列，利于线性DNA末端稳定稳定性：随着插入DNA片段的增大而增加用途：大型基因文库构建YIp质粒*只有大肠杆菌的复制子*引入酵母基因组的同源序列*载体以同源或非同源重组方式整合入宿主基因组*拷贝数：大多情况下为1个以酵母标记基因（his3)的5’端和3’端作同源序列3用于酵母转化子筛选的标记基因营养缺陷型的互补基因显性基因宿主细胞：为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子主要有：LEU-、TRP-、HIS-、URA-载体：携带相应的合成基因如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3选择压力：不完全培养基如：YNB、无机盐培养基营养缺陷型的互补基因显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因aph氨基糖苷转移酶抗G418cat氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1铜离子螯合物耐受铜离子suc2蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂标记基因编码产物遗传表型4酵母菌转化方法原生质体转化法碱金属离子介导转化法电激转化法酵母菌原生质体转化法细胞：去壁的原生质体原理：以PEG等渗缓冲液稳定原生质体，以Ca2+诱导细胞摄取外源DNA。特点：30%以上为多质粒共转化转化效率：可达原生质体总数的1-2%，但操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化细胞：带壁的完整细胞原理：通过碱金属离子（如Li+等）、PEG和热休克处理诱导细胞吸收外源DNA。特点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍共转化现象极为罕见酵母菌电击转化法细胞：带壁完整细胞或原生质体原理：通过电脉冲对细胞膜造成DNA摄取通道特点：转化率高（105/mgDNA）、操作简便、适用范围广5外源DNA在酵母宿主细胞中的命运单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体外源DNA常通过同源或非同源方式与染色体DNA重组线性化DNA更易于同源重组三酵母表达系统甲醇酵母表达系统酿酒酵母表达系统其它酵母表达系统（一）酿酒酵母表达系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母系统启动子酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母糖基化系统1、酿酒酵母启动子UASURSTATA起始位点编码序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、转录起始位点；4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT；5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列;DAS1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脱氢酶基因ADH酿酒酵母表达系统常用启动子2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、GAL1、GAL7和GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差半乳糖诱导、葡萄糖抑制2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录半乳糖诱导、葡萄糖抑制PromoterGAL103）pho4TS-PHO5启动子A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子C、pho4TS温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达低温诱导、磷酸盐抑制酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：性结合因子：MF-α酸性磷酸酯酶：PHO5蔗糖酶：SUC2杀手毒素因子：KIL2、酿酒酵母分泌系统*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用*信号肽结构：酿酒酵母信号肽特点正电荷区疏水区极性区Met目的蛋白信号肽剪切位点*分泌效率高*在酵母系统具有通用性*88个残基组成MF-α信号肽Met目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13编码的二肽酶糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化3、酿酒酵母糖基化系统*过糖基化（超糖基化修饰）：N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。*糖链组成O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团酿酒酵母糖基化特点1）表达水平普遍不高A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）B、所采用的强启动子调控不严谨C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2）分泌表达产物过糖基化4、酿酒酵母表达系统的缺陷酵母菌表达系统的选择酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。酵母菌表达系统的选择乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。酵母菌表达系统的选择巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表达系统长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种酵母菌表达系统的选择多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被多型汉逊酵母表达系统克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。得成功表达。F利用重