肿瘤基因治疗综述

肿瘤基因治疗综述生物工程09-1班殷雨婷肿瘤基因治疗摘要：随着分子生物学、分子遗传学、免疫学等相关学科的发展和渗透，基因治疗特别是肿瘤基因治疗技术迅速发展。肿瘤基因治疗就是将一段特定的遗传信息物质DNA或RNA通过人工方法导入肿瘤细胞以治疗肿瘤性疾病。基因治疗的靶向性是值得密切关注的问题之一，如何寻找合适的靶分子是基因治疗肿瘤的重要方向。本文主要对肿瘤基因治疗的构建、目的基因的靶向性以及内容、应用等方面做了综述。关键词：基因治疗；基因免疫；基因的靶向性；肿瘤细胞。1.构建含有抗肿瘤基因的DNA载体1.1主要步骤获得合适的抗肿瘤编码基因并将它插入到载体DNA上，是发展肿瘤基因治疗的一个主要工作。1.2目的基因的获取表达文库免疫技术，提供了一种在各种已知或未知病原体基因组中获得目的基因的系统而普遍有效的方法。该技术根据病原体的所有抗原都由其DNA编码这一基本原理，将病原体基因文库中的病原体DNA片段插入特定的质粒中，利用基因免疫的方法筛选病原体基因组中具有免疫保护功能的基因片段。目前，基因表达文库免疫技术是发现目的基因的一种最系统、客观的手段。1.3载体的构建质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增，而在动物细胞内则能高效表达，但不复制，也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列。常用的质粒载体启动子多为来源于病毒基因组的巨细胞。1.4目的基因的导入1.4.1间接体内法间接体内法是指在体外用基因转染肿瘤细胞，然后将经转染的肿瘤细胞输入病体内，最终给予病体的疗效物质是基因修饰的细胞。1.4.2直接体内法1.4.2.1定义：直接体内法是指基因片段或完整基因直接注入体内进行治疗的办法。1.4.2.2裸DNA直接注射：将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。1.4.2.3脂质体包裹DNA直接注射：包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏。注射途径类似裸DNA直接注射。1.4.2.4金包被DNA基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞。1.4.2.5繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法：选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其繁殖基因去掉，然后用质粒DNA转化细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA。1.4.2.6经改造的mRNA法：将目的基因的mRNA结构进行重组后直接送入体内。2.目的基因转移的靶向性2.1病毒介导的靶向基因转移目前用于基因转移的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体等，但它们对细胞的感染均无选择性。逆转录病毒的趋向性由其外壳包膜蛋白env和宿主细胞表面特异的蛋白受体间相互作用决定，因此，可通过修饰env基因或env蛋白来改变其感染谱。用能识别肿瘤细胞受体的配体或抗肿瘤特异性抗原的抗体基因取代env基因部分序列，使病毒表达能特异性识别肿瘤细胞的外壳蛋白，从而将目的基因靶向性地导入肿瘤细胞。有人用抗人癌胚抗原（CEA）单链抗体的基因与env重组，使逆转录病毒把一氧化氮合酶（NOS）“自杀基因”靶向导入CEA阳性的肿瘤细胞，并合成NOS使其自杀身亡，而对非靶细胞则无损伤。2.2受体-配体或抗原-抗体介导的靶向基因转移许多细胞表面都特异性地表达或过表达某种受体或抗原，如果使目的基因或携带有目的基因的载体与相应的配体或抗体相连接，利用受体-配体或抗原-抗体相互作用的特异性，就可以把目的基因特异性地导入到靶细胞中3肿瘤基因治疗3.1肿瘤基因治疗免疫反应3.1.1免疫反应基因免疫能引起多种免疫反应：一是体液免疫反应，在绝大多数基因免疫试验中，都能得到编码蛋白的特异性抗体，抗体主要类型为IgG,；二是细胞毒T淋巴细胞免疫反应，基因免疫在抗原提呈细胞内表达的编码蛋白，经过提呈，诱导细胞毒T淋巴细胞产生；三是辅助T细胞反应，基因免疫能激发辅助T细胞的增殖，并伴有细胞因子的分泌，主要的细胞因子为白介素-12[1]和干扰素，属典型的Th1型辅助T细胞反应。还有些试验还发现，基因免疫还有辅助T细胞参与的免疫记忆效应。3.1.2治疗方法针对免疫应答细胞的治疗：用细胞因子基因转染抗癌免疫应答细胞(如TIL、CTL)可增加其抗癌活性，可供选择的目的基因有白介素(IL-1、2、4、6、12等)、干扰素(IFNα和β等)、TNF、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF)等.Rosenbergetal［1］将TNFα基因导入带有标记基因(NeoR基因)的TIL细胞中，使TIL的杀瘤活性大为增强，目前该方案已用于临床试验[1].3.1.3免疫效果肿瘤免疫治疗对于肿瘤的治疗见效较慢，且效果有待进一步提高，正处在实验阶段。3.1.4机理原因3.1.4.1肿瘤没有表达特异抗原或有抗原但缺乏免疫原性；3.1.4.2有些肿瘤能表达特异性抗原但缺乏主要组织相容性复合体(MHC)抗原；3.1.4.3缺乏B7分子的表达，因为近年来发现，T细胞的激活不但需要肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞受体(TCR)的结合，还需要另一“共同刺激”信号B7分子和T细胞膜上的CD28受体的结合才能完成[2];3.1.4.4人体是复杂整体，外源基因进入人体后，尚无法控制其整合与表达;3.1.4.5人体肿瘤多为自发瘤，免疫原性弱，具机体免疫耐受时间长，抗肿瘤免疫难以调动；3.1.4.6外源基因在人体内的转染效率及表达水平均很低，不能满足治疗肿瘤的需要，当务之急应发展高效、低毒的载体。3.2肿瘤遗传基因治疗3.2.1针对癌基因的治疗：即通过反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,Oligos)技术干扰癌基因的转录和翻译，以关闭其表达.癌基因是一个大家族，已发现100余种，因此有多种目的基因可供选择.目前在临床上试用的Oligos主要有硫代磷酸寡核苷(MP.Oligos)［3］.美国Anderson癌症中心经FDA同意，进行首例Oligos治疗恶性肿瘤的临床研究［4］，其方案是取CML患者的白血病细胞以“净化骨髓”，同时给患者施行大剂量化疗和放疗以彻底杀灭体内的肿瘤细胞，再回输净化的自体骨髓.3.2.2针对抑癌基因的治疗：已确定的抑癌基因有DCC、NF1、NF2、RB、P53、WT1、FAP、VHL；新的抑癌基因的后选者有吴(曰)/(文)等1991年分离的RA538和Kaplan等1990年分离RPTPaseγ.针对抑癌基因治疗的策略是恢复由于缺失或突变而丢失的抑癌基因的正常功能.临床前实验研究已取得肯定结果，如人野生型p53基因能抑制复发的T-ALL来源Be-13细胞的恶性表型［5］.但临床上的治疗试验开展甚少.主要是针对这种“替代疗法”存在较大争议，例如以病毒载体导入抑癌基因p53，首先载体是否安全，其次转导p53后对周围细胞有何影响等.3.2.3表达调控治疗：肿瘤的发病存在细胞周期调控基因的异常［6］，刘定干提出［7］通过人工使用药物，对细胞内的功能核酸3′或5′调控区进行控制，来实现基因治疗，而不是控制其编码区.目前正在试验的一些基因疗法是以杀灭细胞为目的，这和常规的手术切除肿瘤并无本质的区别，这些疗法均不能把甚至一个癌细胞变回到正常状态.但是，实践经验告诉我们，癌块周围的许多细胞已经偏离了正常状态.表达调控治疗的指导思想是把癌块周围的细胞和部分癌细胞的恶性度减弱，甚至变回到正常状态.3.3肿瘤的药物基因治疗3.3.1定义：将基因治疗技术与肿瘤化疗药物或药物前体结合起来有选择性杀伤肿瘤细胞和保护正常组织以增强化疗的效果。3.3.2方法：3.3.2.1“自杀”基因疗法：来自原核或低等生物的“自杀”基因(suicidegene)编码的酶类，能使一些药物前体转化而获得对哺乳动物细胞的毒性，并将这些基因导入肿瘤细胞，再伍用相应药物前体，可使肿瘤细胞因表达此类基因而“自杀”.已经发现的这类基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)基因、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(VZV-TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(CD)基因.“自杀”基因的应用是对传统化疗的重大改进在脑瘤的治疗中取得了重大进展，有广泛的发展前景.1992年6月，美国基因治疗公司(GTI)的Culver等经RAC同意，拟选择少数手术无法切除的脑瘤患者开展一项基因治疗计划.目的基因即为HSV-TK.其一期临床研究的部分结果表明，VDEPT(virusdirectedenzymeprodrugtherapy)治疗成人脑瘤有一定效果.8例接受治疗的患者中5例产生应答，其中3例脑瘤萎缩，同时患者对治疗耐受性良好.3.3.2.2肿瘤药物增敏基因疗法：这类基因的产物能使细胞对已有肿瘤化疗药物的敏感性增加.如钙调素基因(CaM)能增加肿瘤细胞对长春花碱类化疗药物的敏感性，降低耐药性，从而增加化疗的效果.3.3.2.3肿瘤药物耐受基因疗法：将肿瘤药物耐受基因导入正常造血干细胞或祖细胞可增加其对化疗药物的耐受剂量，间接地提高化疗的效果.如通过向造血干细胞内导入二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，可使正常细胞获得对氨甲喋呤的耐受性［8］；又如通过导入多相耐药(MDR)基因，如MDR基因，可使正常细胞获得广泛的药物耐受性.这样就可在不损伤正常细胞的前提下，用大剂量化疗药物清除残留的肿瘤细胞.另外，集落刺激因子、促红细胞生成素、白介素等也能增强肿瘤患者骨髓耐受化疗的能力［9］4.肿瘤基因治疗的应用评价4.1存在的问题4.1.1外源基因的表达效率问题。由于在外源基因上游克隆了强有力的启动子和增强子,所以在细胞体外培养时,转入的外源基因得到很高的表达。但当将这些细胞移植到体内后,外源基因的表达显著下降,有些基因甚至下降了1500多倍,具体机理尚不清楚。其次是外源基因表达调控问题。现在试验的基因治疗都是让外源基因持续表达来进行治疗的。但由于精确的基因调控机制目前所知甚少,因此治疗基因还不能做到按需开关。4.1.2反转录病毒载体是随机地将外源基因插入宿主基因组。如果插入不当可能会破坏另一个基因表达或其它基因的激活。4.1.3试验操作时有可能将辅助病毒污染重组病毒,造成病毒在宿主大量扩增。4.1.4现在用于临床基因治疗试验主要是寿命较短的细胞,这样病人就需要重复输入外源基因的细胞,医疗费用大,很难普及开展。4.2研究热点4.2.1通过基因调控进行基因治疗也是基因治疗研究的一个重要方向。4.2.2目前联合治疗成为研究的热点问题。联合治疗包括基因治疗与放疗或化疗间的联合,不同基因治疗策略间的联合等。4.3发展前景基因治疗从设想到实际试验,在短短的时间内已经取得了很大的进展。随着研究的深入,基因治疗中的难题会一个个地被攻克,许多原来被视为“不治之症”的疾病将可运用这一先进行技术得到治愈。参考文献1唐建武白细胞介素－2及其受体与肿瘤基因治疗1995(01)2RosenbergSA.Genentherapyforcancer.JAMA,1992;268(17):2416-24193TownsendSE,AlisonJP.TumorrejectionafterdirectcostmulationofCD+8TcellsbyB7-transfectedmelanomacells.Science,1993;259(5093):368-3704SteinCA,ChengYC.AntisenceOligonucleotidesastherapeuticagents-isthebulletreallymagicalScience,1993;261(5124):1004-10155ReynodsT.Firstantisensedrugtrialsplanndinleukemia.JNatCancerInst,1992;84(5):288-2916ChengT,YeeJK,YearginJ,FriedmannT,HassM.Suppressionofacutelymphoblasticleukemisbythehumanwild-typep53gene.CancerRes,1992;52