兰花组织培养技术

兰花组织培养技术摘要：在适宜的条件下，将兰花植株的外植体在无菌环境中应用人工培养基，通过外植体的采集与处理、培养基的制作、外植体的接种、继代增殖以及驯化移栽等操作技术，可在短期内获得大量幼小的无病毒植株，从而达到增殖扩繁的目的。组织培养技术是经济有效快速繁殖优良品种的方法，也是产生脱毒苗的重要途径。关键词：组织培养兰花外植体试管苗花属兰科多年生草本植物，中国兰花为兰科属中的地生兰。其香味怡人，花色淡雅，品种丰富，素有“花中君子”之称。具有很强的观赏价值和经济价值，深受人们的喜爱。此外，其也是目前世界上栽培较广的切花材料之一，兰花的切花生产，需要大批量的种苗，要获得优质高产，兰花种苗必须具备种性一致，生长齐一，长势旺盛的特点。在种苗生产上运用最广泛的是组培快繁和分株。生产实践证明，运用组织培养快繁技术生产种苗，其长势旺盛，品种复壮，抗病性强，切花质量好，对加快优良品种的培育，挽救珍惜濒危种类等起到十分重要的作用。兰花在植物分类学上属于单子叶植物中的一个科，为多年生草本植物，附生、地生或腐生。兰花根呈圆柱状，属肉质组织，茎很短，高度约为2～3cm，兰叶大多叶边全缘，有的略有锯齿。其花属于不整齐花范畴，总状花序。兰属植物的果实为蒴果，呈三角或六角形，俗称“兰荪“。一、无菌培养物的建立（一）培养容器的洗涤及培养基的制作1.培养容器的洗涤容器的洗涤是否干净直接影响组织培养的成败，为保证培养材料在瓶内生长健壮，在培养前期一定要对容器进行彻底的洗涤与灭菌。以达到“瓶壁锃亮、水膜均匀，不挂水珠”为标准。洗涤时用洗衣粉水洗刷，再用清水冲洗3～4次，干燥后备用。2.培养基的制作培养基是植物组织培养的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到外植体的生长于分化。组培快繁中最常用的培养基主要是MS培养基。母液要根据药剂的化学性质分别配置，一般配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素类母液。其配置方法是先进行大量元素的配置，称量时应注意多余的药品不能回放在瓶中，应做其它处理。电子天平在使用时先对其进行调平，然后进行微量元素母液、有机物母液的配制。当MS母液配好以后，则可进行培养基的制作，继之对琼脂和蔗糖进行称取、溶解，琼脂呈现半透明状时将糖加入容器中溶解，再加入事先吸取好的各类母液混合均匀后转入1L容量瓶中对其进行定容，然后根据培养基的要求对PH进行调整（PH值控制在5.6～5.8测定不得少于3～4次）。进行分装时，一般以培养瓶的1/4～1/3为宜，分装后立即进行灭菌。培养基采用湿热灭菌法，把分装后的培养瓶置入高压锅中进行高温高压灭菌。当压力升至0.11MPa(温度121℃）时，维持15～30min,即可达到灭菌的目的。（二）外植体的采集及接种1.外植体的采集外植体的采集是依据不同的培养目标而异。通常选取一些生长健壮的当年生枝条、饱满而未萌芽的侧芽作为外植体。其取材季节对于大多数植物而言，都应在生长开始的季节采样，对于利用茎尖培养的植物一般材料越小成活率越低，所以茎尖培养成活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1～2个叶原基，约为0.2～0.3mm,茎段长约0.5cm。2.外植体的清洗待外植体采回后，先用流水冲洗半小时左右，使其表面吸附物消除，在转入其他容器中加上洗涤剂进行清洗；在将易感染的各部分剥去、洗净，再切去上部幼叶。3.消毒与接种接种是组织培养是否成功的关键因素。接种前必须对接种室、接种人员，接种材料进行彻底的消毒与灭菌。针对外植体的灭菌处理，则先将外植体在75%的酒精中浸10s，再用蒸馏水冲洗三次。再剥取2～3片叶，放入5%次氯酸钠水溶液5min，再用无菌水冲洗3～4次，剥至留下最后一枚叶片，以生长点为中心切去0.3～0.4cm的方块，将切下的外植体接入准备好的培养瓶中进行培养。外植体经消毒接入启动培养基或者诱导培养基中诱导出花芽，再转入继代培养基中，则诱导产生簇生的原球茎。4.培养培养温度为20～25℃，每天12～16h，光照强度为1000～2000Lx。二、继代增殖经适宜培养后，约4～6周后可在外植体周围形成许多球状物，即原球茎，将其分割接入培养基中，以促使嫩茎长出更多的原球茎，从而分化培养成苗。切取茎尖时要带两个左右叶原基，茎尖大小对增值速率也有影响，同时，继代周期对原球茎增殖也有影响原球茎随继代周期的延长而增加。（一）试管苗生根壮苗培养在生根培养基中，转入单株生长或单株丛生的无根小苗培养其生根。生根培养基多采用1/2MS培养基，加入适量生长素。当小植株生出3～5条水平根，每根长2～3cm时为最适宜的出瓶炼苗阶段。通常将其从根状茎基部切下转入壮苗培养基中培养，培养温度提升至28℃，当苗长至12cm高，具有3～4片真叶时就可以移栽。（二）试管苗的驯化移植试管苗驯化移植是组培快繁的重要环节。移植前可将培养瓶在自然光下炼苗15～20d，以使其感受温差现象，之后再开瓶移植。移植时洗去根部的琼脂，置于阴凉处，待苗木阴干后，就可以移植到通气、透水，保湿基质中。移栽基质对成活率的影响很大，采用蛭石、珍珠岩和木屑混合物加入少量腐殖质含量高的土壤作为基质栽培建兰试管苗，成活率高，可以达到98%以上，植物生长茁壮。如果只用蛭石和珍珠岩作为兰花栽培基质，成活率虽高，但植物生长一般。此外移栽后2周内要采取一定的保温措施。三、影响兰花生根和移栽成活的因素（一）生长调节物质的不同种类及浓度比例的影响生长调节物质主要有生长素、细胞分裂素、赤霉素等，其中生长素对诱导芽、生根和提高移栽成活率有着很大的影响。生长素/细胞分裂素大于1促进生根，生长素/细胞分裂素小于1诱导芽，生长素/细胞分裂素等于1即能促进生根又能诱导芽。（二）无机盐浓度培养基内无机盐浓度高时有利于发生茎、叶，而较低时有利于生根，所以生根培养基多采用1/2MS培养基，加入适量的生长素。因此，降低无机盐浓度对植物生根效果较好，有利于驯化成功。（三）环境因子环境条件也影响试管苗驯化成活率，关键是控制好移植前10d的光、温、湿条件。适当遮阳，避免太阳光直射造成试管苗迅速失水而死亡。温度一般保持在25～30℃为好，相对空气湿度保持在80%～90%。四、兰花组培的应用（一）快速繁殖优良品种实践证明，植物组织培养是快速繁殖培养优良品种的有效手段，并在克服远缘杂交不亲和性、种质资源的保护、杂种胚发育不良等都具有重要价值。同样兰花在组培快繁中也有很高的应用价值。兰花是最早开展组织培养研究的植物之一，也是研究最多发展最快的科属之一。（二）建立无病毒株系一般通过组培技术建立无病毒株系，快速繁殖生产无病毒苗木，采用兰花的茎尖组织培养，就可以脱除病毒，产生脱毒苗。五、结论用组织培养的方法生产兰花试管苗不仅生产周期短，而且繁殖倍数高，周年均可生产，运用现代生物技术手段，可以选育出具备特有商品价值新品种，以提高兰花的观赏价值和经济价值。