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纯化间使用指南2012汪文捷2012.11.19内容来自罗铭师兄2009年报告《细节决定成败ÑÑ纯化间使用指南》以及GE公司官方网站、AKTA全自动层析系统进阶培训资料等。506纯化间管理员：汪文捷205层析柜管理员：柏晓辉纯化间使用指南2012h五大层析h层析柱简介h纯化仪简介h注意事项h附录纯化间使用指南2012h五大层析h层析柱简介h纯化仪简介h注意事项h附录五大层析纯化间纯化间使用指南2012h五大层析h层析柱简介h纯化仪简介h注意事项h附录分子筛分子量相差两倍以上的蛋白才可以通过分子筛进行分离；流动相中推荐加入150mMNaCl，严禁使用无盐buffer过分子筛。抽滤去除固体杂质超声除去部分buffer中所含气体下柱子：先下后上上柱子：先上后下下柱子时请务必保正与柱子连接的注射器内要有足够多的溶液来维持足够的压力。各种分子筛柱子的分离范围分子筛marker(仅供参考)小分子筛marker(仅供参考)脱盐柱离子交换层析柱MonoSMonoQSPFFQHPDEAE使用离子交换柱时，先使用高盐buffer除去杂质（3-5个柱体积），再使用无盐buffer平衡柱子（3-5个柱体积），然后上样。若上样体积较大，可以使用蠕动泵上样。梯度洗脱完毕后，请再用高盐buffer洗3-5个柱体积，最后用低盐buffer平衡柱子（长期储存buffer参见下一页），严禁直接将柱子保存在高盐中。注意：用和离子交换填料带有相同电荷的缓冲液；用相同的离子来调节缓冲液pH；在添加盐后再调节pH；在工作温度调节pH。强离子交换剂：载量在很宽的pH范围内保持恒定；弱离子交换剂：载量随pH而变化。SPHP&QHPMonoS&MonoQ疏水层析“高盐上样，低盐洗脱”第一次试验，通用的条件：结合缓冲液：50mMPBSpH7.0，含有1-1.5M硫酸铵；洗脱缓冲液：50mMPBSpH7.0；梯度：10-15柱体积流速：参考说明书保存：参考说明书注意：疏水层析受pH的影响较小，在pH5~8.5之间，蛋白和疏水填料的吸附几乎没有变化；温度对结合的影响很大，样品和系统的温度务必保持一致。亲和层析•镍柱1.金属离子与组氨酸标签的亲和力：Ni2+Cu2+Zn2+Co2+；Ni2+(最常用)，Co2+(当目标蛋白质和离子的结合希望较弱时)，Cu2+(可以和某些蛋白质强力结合，并且某些蛋白只能和Cu2+结合)，Zn2+(和某些蛋白质的结合比较弱，提供更有选择性的洗脱)。2.流速不影响洗脱蛋白纯度。1mL预装柱推荐1mL/min。3.上样时，缓冲液中咪唑浓度推荐为20~40mM，率度•GST柱：结合通常和流速有关系，低流速可以提高结合量，推荐0.3mL/min。pH和温度也可能会有影响。HisTrapGSTrap常用预装柱的限压及流速设置柱型柱体积(mL)耐反压设置(MPa)建议流速(mL/min)价格(RMB)分子筛S75(S200)1200.5127548小分子筛S75(S200)2410.518857大脱盐柱530.151~57343小脱盐柱50.31~3478Q(SP)HP/FF50.31~3719/769Q(SP)HP/FF10.31~2290/343MonoQ(S)14117050MiniQ(S)0.8318116004[注]其他预装柱限压及流速设置请咨询管理员，或自行查询GE公司《凝胶选择指南2012》。[注]限压超过1MPa的预装柱只能在purifier上使用，prime及plus最高限压只能到1MPa。纯化间使用指南2012h五大层析h层析柱简介h纯化仪简介h注意事项h附录ÄKTAexploreramershambioscienceamershambioscienceamershambioscienceamershambioscienceBoxMonitorConductivitypHUVDetector3WavelengthsPumpsColumnValvesInjectorSampleValveBufferspH/cellelectrodeSampleholderPumpABufferswitchingvalveOutletValveFractioncollectorAKTAPurifier纯化系统电导仪紫外分光光度计pH计AKTAPurifier纯化系统局部细节AKTAPrime(Plus)纯化系统pH计紫外分光光度计电导仪AKTAPrime(Plus)纯化系统局部细节注：新Plus没有配备pH计样品收集器AKTAPrime(Plus)纯化系统取下转盘时需要注意的细节向这边扳开转动或取下转盘时，请务必扳开！关于EP管的小细节Prime（Plus）Purifier纯化仪流路进气处理仪器流路进气时，从此处抽水Prime/PrimePlusPurifier纯化间使用指南2012h五大层析h层析柱简介h纯化仪简介h注意事项h附录预约注意事项hblock时间：8:30-13:00，13:00-17:30，17:30-22:00。为了自己和他人的实验，请勿延时0.5h以上。h为了防止分子筛进气，严禁过夜使用纯化仪。h预约登记时，请将姓名(或字母简称)，蛋白名称，柱型，buffer(如：100mMNaCl，20mMTris8.0)填写完整，缺少相关信息将被视为无效预约。h请规划好自己的实验，严禁恶意超额预约或预约不用。(如：下午才需要过分子筛的话，不得预约上午的block。)h同时预约两台以上纯化仪(含两台)，请告知纯化间管理员。Buffer使用注意事项h过预装柱用的buffer一定要经过抽滤、超声除气后方可使用，放置时间较长的buffer，即使没有长菌也请重新抽滤除气。h过预装柱用的buffer一定要有预留量，以防止进气。如过分子筛时，需要配置至少500mLbuffer（120mL平衡+120mL过柱子+50mL平衡上样环+100mL预留量）。hBuffer中如果需要加入添加剂（如：甘油、去垢剂等），请务必查阅预装柱说明书，确认该添加剂对柱子填料无损害后方可使用。h严禁在分子筛上换buffer，尤其严禁跨越等电点！换buffer请使用透析、浓缩-稀释等方法，如果不跨越等电点，也可以使用脱盐柱。h预装柱在使用高盐buffer之后，一定要在最后换回到低盐buffer（最好是20%乙醇）环境中，以保护柱子填料。（包括使用脱盐柱时请务必等小分子峰出完再收回柱子。）h纯化完毕后，请将吸水管放回20%乙醇的蓝盖瓶，尽快收回自己的buffer（包括过镍柱时使用的50mM离心管等），在纯化间任何放置一天以上或者标示信息不完整（尤其没有姓名和buffer配方）的个人buffer将随时被清理。其他使用注意事项h过分子筛前，请优化好Ni柱洗脱条件，6mL离心后上样。尽量不要浓缩后上样（避免蛋白沉在柱子上）或大体积上样（影响分离效果）。h当分子筛流速1mL/min时柱压超过0.3MPa，请通知纯化间管理员；柱压超过0.4MPa时务必停止使用并通知管理员。MonoQ和MonoS(4MPa)最大流速0.5mL/min时，请通知管理员。h换柱子时，请将接头放入专用小烧杯中；使用Q柱，S柱，脱盐柱时，请妥善保管封口头，切勿丢失。h分子筛用完可保持原样，但用完Q柱，S柱，脱盐柱后，如之后没有人过相同柱子，请处理好柱子后，换回分子筛。h如果分子筛进气，新手请尽快通知组长或纯化间管理员；如果有经验，可以用30%异丙醇排气。h205实验室层析柜中的prime和plus在使用完之后，请勿关闭纯化仪电源，保持仪器通电状态，放置水汽在仪器电路上冷凝造成短路。在非运行状态不必特意关闭紫外灯，此时紫外灯默认关闭。但平衡柱子时，为节约紫外灯，请务必保证紫外灯处于OFF状态。关于去垢剂和蛋白酶h使用蛋白酶（纯化蛋白酶(包括3C酶或TEV酶)或是部分酶解后样品、TEV酶切后样品）和去垢剂的同学请尽量使用贴有Ô蛋白酶”或者Ô去垢剂”标签的柱子。h使用蛋白酶和去垢剂的同学，有义务预约1.5个block，后0.5个block请用普通buffer清洗一个柱体积以上（120-140mL）。h仪器和柱子清洗1+1个柱体积（240mL）以后，不会对普通蛋白产生影响，请放心使用。纯化间使用指南2012h五大层析h层析柱简介h纯化仪简介h注意事项h附录506纯化间保存的未开封预装柱目录。如有需要请在周老师或陈老师同意之后，联系管理员开封使用。凝胶过滤预装柱预装柱柱体积(ml)特性/应用数量SuperdexPeptide10/300GL24肽/小分子1Superdex7510/300GL24蛋白/肽/核苷酸/小分子1Superdex20010/300GL24蛋白/DNA/小分子1Superose610/300GL24蛋白/肽/寡核苷酸/核酸/多糖1HiPrep26/60SephacrylS-200HR320蛋白，如：血清蛋白(白蛋白)1HiPrep26/60SephacrylS-300HR320蛋白，如：膜蛋白和血清蛋白(抗体)1HiTrapDesalting5脱盐3HiTrapDesalting53脱盐2离子交换预装柱预装柱柱体积(ml)特性/应用数量MiniQ4.6/50PE0.83极高分辨/微量纯化和分析1MiniS4.6/50PE0.83极高分辨/微量纯化和分析1MonoQ5/50GL1纯化和分析3MonoS5/50GL1纯化和分析3HiTrapQHP5少量样品纯化6HiTrapSPHP5少量样品纯化5HiTrapQFF5蛋白制备7HiTrapSPFF5蛋白制备6HiTrapDEAEFF5蛋白制备3HiTrapCMFF5蛋白制备3HiPrep16/10SPXL20蛋白快速半制备/初步分离纯化1HiTrapCaptoQ1高流速/高载量1HiTrapCaptoS1高流速/高载量1HiTrapCaptoDEAE1高流速/高载量1HiTrapCaptoMMC1耐受高盐，可在高盐下吸附蛋白的弱阳离子交换柱1HiTrapCaptoadhere1多位点/用作抗体穿透/一步吸附HCP、DNA等杂质1亲和预装柱预装柱柱体积(ml)特性/应用数量HisTrapHP1预装NiSepharoseHP填料13HiTrapChelatingHP1未螯合金属离子，可根据需要在柱子开封后自行螯合Cu2+或Zn2+28GSTrapFF1GST-tag2GSTrapFF5GST-tag5HiTrapNHSactivatedHP1通过游离氨快速与亲和配体结合3HiTrapHeparinHP5纯化抗凝血激酶和别的凝集因子，脂蛋白、酯酶、激素、DNA结合蛋白等4HiTrapBenzamidineFF1专门纯化丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和类胰蛋白酶5MBPTrapHP[注]1MBP-tag5注：MBPTrapHP暂时没有，已经向GE订货，2013年1月份到货。疏水预装柱预装柱柱体积(ml)特性/应用数量RESOUCEETH1蛋白/肽的快速高分辨率疏水纯化1RESOUCEISO1同上1RESOUCEPHE1同上1HiTrapPhenylFF(LS)1小量制备2HiTrapPhenylFF(LS)5小量制备5HiTrapPhenylFF(HS)1小量制备2HiTrapPhenylFF(HS)5小量制备3HiTrapButylFF1小量制备1HiTrapButylHP1小量制备1HiTrapButyl-SFF1小量制备2HiTrapOctylFF1小量制备2HiTrapPhenylHP1蛋白纯化1Thankyou！