实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶

亲和层析法纯化胰蛋白酶一．实验目的1.理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。二．实验原理亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。这种分子之间的结合能力做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”。在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（Ligand），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B）制成亲和吸附剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH=2-3时，又能被解离下来。采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到10-20倍以上。三．实验方法步骤1.鸡卵粘蛋白的制备取蛋清60ml，加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮：三氯乙酸=40:60）后，出现大量白色沉淀，搅匀后室温静置4h以上，待清蛋白完全沉淀，3000rpm离心10min，弃去沉淀，47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好，置于冰箱中冰浴片刻，缓慢加入3倍体积(141ml)的预冷丙酮，搅匀后冰浴4h直到出现沉淀,用真空泵抽去部分上清液，剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中，以3000rpm下离心15min，弃上清液。离心管底部沉淀物放置真空干燥器内，抽气去丙酮，然后用20ml蒸馏水溶解。之后将鸡卵粘蛋白溶液装入透析袋内对蒸馏水透析。将透析液转移到离心管内，再次以3000rpm下离心15min。2.鸡卵粘蛋白含量测定取上述离心液0.5ml稀释6倍，测A280nm，求其浓度，由于浓度值过大，再次稀释10倍，测A280nm，得到最终的浓度。3.胰蛋白酶的比活性测定在比色杯中加入2.95mlBAEE底物溶液和20μl的胰蛋白酶溶液，在λ253nm的条件下测定4分钟内的A253，算出∆A的值。4.鸡卵粘蛋白的抑制比活性测定以苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物测定胰蛋白酶的活性。先在试管中加入0.14ml0.1mol/lpH7.8tris-HCL缓冲液，0.07ml胰蛋白酶溶液及0.07ml鸡卵黏蛋白溶液，混合后在25℃水浴加热放置10min，使胰蛋白酶和鸡卵黏蛋白充分结合，然后取反应混合液0.2ml，加到装有2.8ml底物溶液的比色皿中，迅速测定其在波长253nm的条件下，4min的A253，求得其比活性。5.载体Sepharose4B的活化将适量的Sepharose4B，用0.5mol/lNaCl淋洗后用蒸馏水洗净NaCl，抽干后移至小烧杯中，加1.5mol/lNaCO3150ml，将装有Sepharose4B的小烧杯放置在一个冰浴里振荡2h，用电动磁力搅拌器缓缓搅拌，反应器内的温度保持在5℃左右。称取2g溴化氰放入一个烧杯中，加入5ml乙肼使溴化氰完全溶解，取移液枪向装有凝胶的烧杯中滴加溴化氰，直到溴化氰加完后继续反应5min。停止反应，将凝胶迅速转到玻璃烧结漏斗内用抽滤，用蒸馏水洗涤后再用20ml0.2mol/l，pH9.5Na2CO3缓冲液洗涤,抽干后偶联。6.鸡卵粘蛋白与活化的载体Sepharose-4B偶联将已活化好的Sepharose-4B转移到三角瓶中。用10ml0.2mol/L，pH=9.5Na2CO3缓冲液将上述制备好的20ml卵粘蛋白溶解，溶液全部转移到三角瓶中与活化好的Sepharose4B偶联。在4℃恒温摇床振荡24小时左右。偶联终止后，将凝胶倒入玻璃烧结漏斗中抽干并用100ml0.5mol/LNaCl溶液洗去未偶联上的蛋白（收集滤液，测蛋白含量以计算偶联蛋白量）,再用100ml蒸馏水淋洗。接着用50ml亲和洗脱液（0.1mol/L甲酸—0.5mol/LKClpH=2.5）淋洗。最后用蒸馏水洗至中性，浸泡于亲和柱平衡（0.05mol/LCaCl2-0.1mol/LpH=7.8Tris-HCl缓冲液）中，放冰箱待用。7.亲和层折纯化胰蛋白酶取层折柱一支，柱内装入1/4体积的亲和柱平衡液，亲和吸附剂一次装入柱内，自然沉降，调好流速(2-4ml/min)，亲和柱平衡液洗至流出液在检测仪上绘出稳定基线，测定其OD值小于0.02即可。将胰蛋白酶粗提液pH调至8.0，过滤，取清液上柱吸附，亲和柱平衡液流至流出液在检测仪上绘出的曲线回归到原来基线水平，测定的OD值小于0.02即可。用亲和柱洗脱液洗脱，收集胰蛋白酶峰，测胰酶的比活及含量。整个实验流程为：鸡蛋清Spharose4B↓↓提取活化↓↓分离纯化↓↓↓纯卵粘蛋白(CHOM)→←活化Spharose4B↓偶联↓CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓亲和层析↓酶促动力学←纯胰蛋白酶→酶含量、活性测定四．实验结果1.鸡卵黏蛋白浓度值将稀释6倍测得A280nm=0.965代入公式：鸡卵黏蛋白浓度（mg/ml）=413.0*nm280稀释倍数A≈14.02mg/ml，要获得的浓度值在0.2mg/ml，则需要再稀释10倍，测定A280nm=0.100，鸡卵黏蛋白浓度为0.242mg/ml2.鸡卵黏蛋白抑制比活性值项目A253T/sttttttttttttttt/s0306090120150180210240未加抑制剂的胰蛋白酶0.0220.0550.0870.1100.1380.1570.1880.2210.232加入抑制剂的胰蛋白酶-0.117-0.111-0.074-0.074-0.060-0.036-0.0030.0150.043(1)胰蛋白酶活性（BAEE）=001.0min/nm253A，则未加抑制剂的胰蛋白酶的∆A253nm/min=(0.232-0.022)/(4*0.001)=52.5BAEE(2)胰酶比活性（BAEE/mg）=酶体积胰酶浓度胰蛋白酶活性*=5.2*05.0*/mg27.05.52mlml=9722BAEE/mg(3)鸡卵黏蛋白比活性（胰蛋白酶BAEE/mg）=抑制剂的体积抑制剂的浓度的加入抑制剂的胰蛋白酶酶的未加入抑制剂的胰蛋白**001.0)(-)(min/nm253min/nm253AA加入抑制剂未加抑制剂=05.0*242.0*001.04/)117.0(043.04/5.2*022.0-232.0）（=7520BAEE/mg3.偶联蛋白量淋洗液滤液体积/mlOD280NaCl溶液淋洗1170.171亲和洗脱液470.000亲和柱平衡液521.348偶联蛋白含量=14.02mol/L*20ml-(0.171*117ml/0.413+1.348*52ml/0.413)=62.23mg4.酶蛋白含量、比活性测定（1）亲和层析分离胰蛋白酶层析图（2）4min内测得的OD值测定T/s306090120150180210240270OD2530.0210.0600.0940.1290.1640.1860.12160.2510.275测定的酶蛋白OD280=0.767，则浓度=0.767/1.35=0.568mg/ml酶蛋白含量=0.568mg/ml*22ml=12.5mg胰蛋白比活性=（0.275-0.021）/(4min*0.001*0.568*10μl*10-3)=11180BEAA/mg五．数据分析与讨论（1）鸡卵黏蛋白的浓度约为14.02mg/ml，选用的是稀释6倍得出值，这与稀释60倍反推浓度值是不一样的，存在着实验误差。在测定鸡卵黏蛋白抑制比活性值时，加入抑制剂得到的OD值随时间t变化曲线性不好，在60s有一个很大的波动，同时在4min的时刻，从曲线中看不出反应是否结束，所以我觉得应该舍弃60s之前的数据，将时间控制在1.5min-5min范围内得到的才能更好的反应它的鸡卵黏蛋白抑制比活性值。通过观察未加抑制剂的胰蛋白酶与加抑制剂的胰蛋白酶的OD值曲线，可以看出两条曲线斜率相近，表现出抑制效率在该时间段内是相等的。（2）在鸡卵粘蛋白与活化的载体Sepharose-4B偶联终止淋洗阶段，洗脱液洗脱之后的滤液测定的OD值为0.000，说明洗脱效果显著。得到的偶联蛋白含量为62.23mg，偶联率为62%，偶联效果还不错。（3）亲和层析分离胰蛋白酶层析图中出现了两组峰值，第一是杂蛋白的洗脱峰，而需要测定胰蛋白需要收集的是第二个洗脱峰。层析效果较好，则收集到的蛋白纯而含杂质较少。测定胰蛋白比活性的OD值随时间t变化曲线性较好，说明加的酶（10μL）和抑制剂(2.99ml)的用量合适。我们组刚开始加的酶量为15μL，反应很快达到平衡，曲线斜率高。通过这个变化可知，在测定胰蛋白酶活性及抑制剂抑制活性时，应注意酶和抑制剂的用量，若酶用量较大，则反应很快达到平衡，动力学曲线斜率高；反之，若用量小，则反应缓慢，达到平衡所需时间较长，动力学曲线斜率低。同理，抑制剂用量过大，则很快抑制了酶的活性；反之，则酶活性下降很少，动力学曲线会产生较大的偏差。通过实验数据可知亲和层析法得到的纯胰蛋白酶比活可达1.118*104BAEE单位/mg，纯化效率为10倍以上，获得的胰蛋白酶纯度高。（4）pH值及温度的调控在本实验中至关重要，因为鸡卵黏蛋白和胰蛋白酶都是蛋白质分子，对pH值和温度都有相应的耐受区间。比如胰蛋白酶应保存在4℃冰箱中，用时迅速拿出，取样后再迅速放入，才能尽量避免失活。同时pH值不能小于2，否则易引起酸变性，pH大于5时开始表现一定的活性；pH7.6时，表现活性；pH8.0时，活性最高；当pH大于8．5时，酶活性反而降低，这是困为胰蛋白酶在碱性条件下水解自溶的缘故。所以在每一个步骤当中，都需控制好溶液的pH值及温度。才能保证实验的顺利进行。