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1iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统操作说明iCycleriQTMMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystemOperatingInstructionsCatalogNumber170-8740如与英文版说明书有不符之处以英文版说明书为准22．iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统操作速成2.1简介：iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统可以最多一次检测96个样品，且每个样品中同时可以检测4个不同波长的荧光信号。也就是说，只要标记不同荧光探针，iCycler可以对同一个孔中两种以上的PCR产物（最多四种）同时进行实时分析。这样对多重PCR反应或使用内对照（InternalControl）定量的PCR反应的检测就十分方便。在反应过程中，不同的荧光信号通过与其匹配的不同波长的滤光镜组来检测。比如，在一个反应管中同时有四种荧光探针共存，分别标记了FAM、HEX、TexasRed®和CyTM5，在收集其荧光信号数据的时候，必须同时使用FAM滤光镜组、HEX滤光镜组、TexasRed滤光镜组和Cy5滤光镜组。所有的收集的信号由iCycler的软件进行分析整理，在PCR反应结束后，该软件可以显示其各自的荧光曲线和标准曲线，并得到这四种荧光探针分别对应的靶DNA的定量结果。在每次使用iCycler进行PCR荧光定量实验之前，系统必须获得孔间差异因子（WellFactor）和纯染料校准（PureDyeCalibration）的数据。系统通过这些数据来区分不同的荧光信号，矫正孔间的误差。本章节将详细的介绍这两者的调节方法。您在使用本仪器前请先仔细阅读本章的内容，这将有助于您能够快速地完成实验并获得理想的实验数据。2.2：iCycler操作速成1.开机前先让摄象系统预热30分钟。接通iCycler的电源，并连上电脑，打开iCycler的软件。如果本仪器在上次使用后被搬动过，请在RunTimeCentral模块中的ImagingService窗口检查遮光框的校正情况，详见6.2。2.如果要使用新的荧光染料/滤光镜组，必须进行一次纯染料校准（PureDyeCalibration），使系统获得相关数据，详见2.4。3.在96孔薄壁反应板（96-wellThinWallplate，产品序列号223-9441）内加入PCR反应试剂和待测样本。完成后在反应板上盖一块光学级封带（OpticalQualitysealingtape，产品序列号223-9444），用封带涂抹器（塑料扁平齿）3将其涂抹光滑。注意，无论带不带手套，都不要让手指接触到封带表面。完成后撕去封条四周的白条。如果不用96孔薄壁PCR反应板，而是用单独的PCR反应管或八连管时，请在加完样品后盖上相匹配的盖子。注意，为防止放入iCycler的PCR反应管被压碎，在使用绿色抗凝环（greenanticondensationring）时至少放8个反应管；如果没有使用该环，则至少要加14个反应管。4.在ProtocolWorkshop模块中设置PCR热循环的程序（thermalprotocol），包括温度、时间、循环次数等参数的设置。详见5.1。5.在ProtocolWorkshop模块中设置反应板设置文件（PlateSetup）。先创建一个新的反应板设置文件，再根据本次实验的所用的荧光染料选择其对应的滤光镜设置文件（FliterWheelSetupfile），详见5.2.5。最后，在设置窗口的96孔模拟布局图中选择本次实验使用哪些孔、样品类型（sampletype）以及要检测的荧光基团种类。如果样品类型是标准品的话，还要输入其对应的量。全部完成后再点击“ViewPlateSetup”键，进行确认。详见5.2。6.确认上一步中选择的滤光镜组是否就位。详见5.2.5。7.如果实验需要使用孔间差异矫正板（externalwellfactorplate）进行系统孔间差异矫正的，先将该板放入iCycler；如果是使用反应板内部矫正的，直接将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler。详见2.3。在ProtocolLibrary模块中“ViewProtocol”窗口选择PCR热循环文件；同样在该模块的“ViewPlateSetup”窗口选择反应板设置文件。完成后按“Run”键。8.随后系统自动切换到“RunPrep”窗口，用户在此确认PCR热循环文件和反应板设置文件是否正确。在“Samplevolumeis”文件框中输入反应体系的体积；根据本次实验内容在“IdentifyProtocolAnalysis”中选择是PCR定量/熔点曲线（PCRQuantification/MeltCurve）还是纯染料校准（PureDyeCalibration）；在“WellFactorSource”中选择系统孔间差异矫正是使用孔间差异矫正板（WellFactorPlate）还是使用反应板内部矫正（ExperimentalPlate）。一切都完成后点击“BeginRun”键（见图2.1）。9.给本次的数据记录文件（opd文件）起名。410.如果是使用反应板内部矫正的，系统会在PCR反应前自动收集孔间差异因子的数据；如果使用了孔间差异矫正板，则系统会先用大约5分钟时间收集孔间差异因子数据，然后自动进入暂停模式（PauseMode）。取出孔间差异矫正板，将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler中，盖好。点击“ContinueRunningProtocol”（见图2.6）。11.PCR循环开始后，系统会打开Run-TimeCentral模块对实验进行实时监控。当实验进行到荧光收集循环时，DataAnalysis模块会自动打开，进行数据的收集和分析。2.3：孔间差异因子（WellFactor）在采用荧光实时法对PCR反应进行检测的过程中，反应管之间的差异对结果的准确性有一定的影响，这就是所谓的孔间差异因子（WellFactor）。为了获得更科学更真实的结果，iCycler在PCR反应开始前必须获得孔间差异因子的数据，以便于对每个反应管中荧光信号强度进行矫正。一般矫正孔间差异因子的方法有两种，一是用孔间差异矫正板（WellFactorPlate），二是反应板内部矫正。相较而言，在这两种方法中，采用反应板内部矫正是较简单较科学的方法。这种方法得到的矫正数据也叫动力学孔间差异矫正因子。使用这个方法的前提是在每个反应管中必须含有相同浓度同种成分的荧光基团。比如，在一块反应板的5每个反应管中都加入50nM荧光素，100nmHEX，125nMTexasRed和200nMCy5，就可以使用反应板内部矫正。但如果某管中和其他管成分不同，比如某管中荧光素含量为100nM或200nM的话，这种方法就不可行了。如采用反应板内部矫正，在“RunPrep”窗口的“WellFactorSourse”选项框中选择“ExperimentalPlate”选项即可（见图2.1）。系统软件会在PCR反应前自动收集孔间差异因子的数据。如果在实验中采用如SYBRGreenI或溴乙啶等能与DNA结合的荧光染料，那么上述方法就无效了。因为在PCR反应的靶DNA预变性过程中，这样的荧光信号强度比较弱，统计所得的孔间差异因子的数据偏差较大。解决这个问题的方法有两种，一是采用孔间差异矫正板；二是在PCR主反应液中加入微量的荧光素稀释液（详见2.3.2）。加入这种稀释液后，在95oC下SYBRGreenI等的荧光信号强度会增加，这样用反应板内部矫正也能得到较准确的孔间差异因子的数据。2.3.1：孔间差异因子数据来源（WellFactorSource）：反应板内部矫正（ExperimentalPlate）如果使用反应板内部矫正的话，荧光探针必须没有二级结构（在纯染料校准时也必须解开二级结构），所以必须在PCR反应板第一次被加热到90oC以上的6时候系统才会开始收集荧光信号，并得到孔间差异因子的数据。2.3.2：使用反应板内部矫正来进行孔间差异因子矫正操作指南如果选择使用反应板内部矫正，系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入执行一个名为“Dynaicwf.tmo”的文件，95oC加热90秒。这样用户在设置PCR热循环文件的时候就要考虑到这一点，在预变性段中要减去相应的时间。比如，您本来的设定是95oC预变性10分钟，这一来您就要改成95oC预变性8.5分钟。在执行这个插入文件的过程中，被选定的滤光镜组会进入工作位置，系统软件开始收集各反应管中的荧光信号，统计孔间差异因子。当这些完成后，系统软件的Run-timeCentral界面中会跳出提示信息（见图2.3）。如果用SYBRGreenI，那么我们建议调节PCR主反应液的荧光染料终浓度为10nM。先将1mM的荧光素校准染料（FluoresceinCalibrationDye，产品序列号170-8780）用PCR缓冲液（10mMTris，pH8.0，50mMKCl，3mMMgCl2）稀释1000倍，配成1μM的稀释液。然后按照稀释液：PCR主反应液=1：99的比例进行配制，比如10μl1μM稀释液加990μlPCR主反应液，这样就能得到荧光素终浓度为10nM的PCR主反应液。在反应板内部矫正完成后，系统软件会将其数据储存在本次实验的数据记录（opd文件）中，然后自动开始执行设定的PCR热循环文件。2.3.3：孔间差异因子数据来源（WellFactorSource）：孔间差异矫正板（WellFactorPlate）当一次实验中各反应管中所含的荧光基团的种类和含量不同，比如某反应7管含有200nM荧光素而其他反应管只含100nM，或者某反应管用的是TexasRed而其他都用荧光素。象这样的情况下，孔间差异因子只能用孔间差异矫正板来矫正。所谓的孔间差异矫正板，就是一块和本次实验一样的PCR反应板，其反应管与实验用PCR反应板的反应管顺序一一对应。在孔间差异矫正板上，每个反应孔中含有和对应的实验用PCR反应板的反应管中相等体积的溶液以及相同种类和浓度的荧光基团。比如本次实验用PCR反应板的A1反应管内PCR反应液的总体积是50μl，100nM荧光素，那么孔间差异矫正板的A1反应管也加50μl液体，100nM荧光素。如果您一个反应管中含有不止一种荧光基团，那么我们建议您在孔间差异差异矫正板上使用我们伯乐公司的孔间差异矫正板稀释液（ExternalWellFactorPlateSolution，产品序列号170-8794），当然只有一种荧光基团也可以使用本产品。2.3.4：制备孔间差异矫正板本公司提供的孔间差异矫正板稀释液是10×的，使用前先用ddH2O稀释10倍。然后在孔间差异矫正板的反应管中加入与其对应实验用PCR反应板反应管内PCR反应液相同体积的1×孔间差异矫正板稀释液和同样成分的荧光基团。比如实验用PCR反应板A5反应管内有50μlPCR反应液，100nM荧光素，那么孔间差异矫正板的A5反应管同样要加入50μl1×孔间差异矫正板稀释液（内含荧光素100nM）。加样完毕后，在板上盖一块干净的光学级封带。将板略微离心一下，使各反应管管壁上没有液体残留，全部流到反应管底部。您可以在Run-TimeCentral模块的ImagingService窗口确认准备好的孔间差异矫正板中每管的荧光信号遮光框有没有调节好，CCD照相机像素有没有饱和（详见6.2）。2.3.5：使用孔间差异矫正板来进行孔间差异因子矫正操作指南在一块PCR反应板上进行不同的实验项目或纯染料校准时只能使用本法矫正孔间差异因子。8将准备好的孔间差异矫正板放入iCycler，盖上热盖。在ProtocolLibrary模块中选择PCR热循环程序和反应板设置文件，然后点击“Run”。在“RunPrep”界面中的“WellFactorSource”选项框中选择“WellFactorPlate”选项。其他选项相同。完成后点击“BeginRun”。此时系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入