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园艺植物育种学总论实验指导书黄桂香编著广西大学农学院园艺系2013年3月2目录实验一园艺植物花粉生活力测定(3h)…………………………………3（一）果树花粉生活力测定………………………………………………3（二）蔬菜花粉生活力测定………………………………………………6实验二、三园艺植物开花习性观察及有性杂交育种(6h)……………7（一）果树开花习性观察及有性杂交育种………………………………7（二）蔬菜开花习性观察及有性杂交育种………………………………8实验四、园艺植物品种描述及鉴别(3h)…………………………………10（一）番茄品种描述及鉴别………………………………………………10（二）荔枝品种描述及鉴别………………………………………………13实验五、种胚分离培养技术(3h)…………………………………………16实验六、园艺植物选择育种(3h)…………………………………………17实验七、园艺植物品种调查及育种方案的制订(6h)……………………20实验八、园艺植物花粉单核期观察(3h)…………………………………203实验一、园艺植物花粉发芽试验及生活力测定内容一：果树花粉发芽试验及花粉生活力测定一、目的要求练习并掌握果树花粉发芽试验及花粉生活力测定技术二、材料用具供试花粉、氯化钙、硼酸、琼脂、蔗糖、凹玻片、棉花、染色瓶、蒸馏水、显微镜、计数器、天平、载玻片、盖玻片、烧杯、镊子、水浴锅、玻璃杯、玻棒、冰箱、温箱、干燥器等。联苯胺、α—萘酚、碳酸钠、酒精、过氧化氢、氯化三苯基四氮吡、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、量筒、量瓶、滴瓶等。安全提示：因联苯胺、α—萘酚、氯化三苯基四氮唑为易制毒化学品，操作时要按规范要求，避免人体直接接触，注意安全。三、说明在有性杂交工作中，常因杂交亲本组合的花期不遇，或亲本植株异地而必须预先收集父本花粉，花粉应贮藏在低温(0—4℃)，干燥(相对湿度0—4%)不受阳光直射(或黑暗)的环境下，可以较长时间地保持花粉的生活力，经贮藏或外地采来的花粉，在授粉之前，必须检验花粉的生活力，以确定花粉发芽的可靠程度，这对检验杂交后的效果，具有重要意义。花粉人工发芽的效果与培养基的配制是否适合有很大关系，培养基常用不同浓度的蔗糖和琼脂1%及蒸馏水配制而成，不同果树的花粉对蔗糖浓度要求不同。一般柑桔花粉要求蔗糖浓度以10—15%为宜；苹果及梨以10—15%为宜，桃以10%为宜。通过控制蔗糖浓度的高低可调节培养基的渗透压，防止播种的花粉在培养基上发生破裂现象。培养基一般以微酸性为宜，pH值相应调整在6—5.2之间，发芽温度控制在20—25℃，并需要空气和较高的湿度。如在培养基中加入少量的硼酸和维生素B1，更可促进花粉发芽。测定花粉生活力，同样是检查花粉的质量，因为做花粉发芽试验时，操作较复杂，设备要求较高，需时也较长。为了简易而迅速地测定花粉的生活力，也有用化学染色的方法测定花粉生活力，但此种方法有一个很大的缺点，就是不能真实地反映出有发芽力的花粉究竟有多少，因为即使染上色的花粉也不一定都具有生活力。所以一般常用而且较为可靠的方法仍然是采用花粉发芽试验，而染色法作为一种粗略的快速测定，还是比较简便的。四、方法和步骤(一)花粉发芽试验(1)培养基的配制：在100毫升蒸馏水中，加入琼脂1克，蔗糖(按果树花粉种类不同的比例加入)和0.01g的硼酸共同置于烧杯中加热煮沸，使琼脂和蔗糖等充分溶解于水中，在加热过程中，由于水分蒸发，必须加入失去的水分，才能保持准确的浓度，然后将烧杯置于水浴锅中(或盛热水的烧杯中)备用，以防培养基冷却凝固(2)发芽床的装置：用玻棒将冷却前(约50℃)的培养基滴入凹玻片的凹孔中(1—2滴)，要求培养基表面必须园正，待其凝固后用作播种花粉之发芽床。(3)播种花粉用接种丝或头发沾上花粉(花粉事先收集使之干燥，贮藏于干燥器中置于冰箱内)少许，均匀地播种于培育基表面，播种时要防止花粉成团堆集4于培育基上；也要防止花粉埋入培养基过深，影响花粉发芽。播种后要在显微镜下检查，花粉分布是否均匀。花粉堆积过多难以计数，而过少则影响发芽。以每一视野中（10×10）分布有100—200粒左右花粉为宜。播种完毕后，将凹玻片插入染色瓶中(染色瓶底事先放入少量的脱脂棉，并加入适量的无菌水)，盖上瓶盖。再在染色瓶上贴上标签，注明花粉种类，蔗糖浓度，采集时间，播种时间，工作者姓名等。然后置于温箱中（温度调至25—28℃左右）。(4)播种后的检查：播种根据树种不同，隔不同时间在显微镜下，检查花粉发芽情况、苹果、梨、桃在3—4小时后检查第一次，以后每隔2—4小时检查一次（北方可适当缩短2次之间的时间），柑桔在24小时检查一次。每次检查三个视野（最好能固定视野检查。如不能固定视野检查，则每次检查的视野不能重复）。同时用计数器统计出花粉总粒数及发芽粒数，直至花粉粒数不再增加为止，花粉发芽标准，以花粉管伸长超过花粉直径为准。表一花粉发芽记载表供试品种收集时间播种时间蔗糖浓度第一次第二次第三次总发芽率%时间总数发芽率时间总数发芽率时间总数发芽率(二)花粉生活力测定1、B、C夏尔达考夫染色法：具有生活力的花粉粒中，含有过氧化物酶，它能促使过氧化物放出活性氧，这种氧是在花粉萌发时，进行的许多综合反应时所必需的。因此，通过对过氧化物酶的测定，可间接地判断花粉是否具有生活力。(1)预先配制下列溶液①0.20克联苯胺溶于100毫升50%酒精溶液中。②0.15α-萘酚溶于100毫升之50%酒精溶液中。③0.25克碳酸钠溶于100毫升之蒸馏水中。以上三溶液分别装入棕色瓶中贮藏备用(或用量瓶放在暗色避光处)，使用时将上述三种溶液等量混合，配成混合液，装于棕色滴瓶中备用。④在使用前配好0.3%过氧化氢溶液，装于棕色滴瓶中备用。(2)操作步骤：在载玻片上加入少量待测花粉，然后在花粉上滴一小滴混合液和一小滴过氧化氢溶液，用玻棒把花粉和溶液充分混合，再盖上盖玻片(盖上后常出现很多气泡，不要把气泡认为花粉)，经过3—4分钟后，在显微镜下检查被染色和未染色5的花粉粒数，因联苯胺被氧化后呈兰色，α—苯酚被氧分后呈红色，同时被氧化则呈紫红色，因此联苯胺，α—苯酚和过氧化氢的混合液同时参与作用下，凡具生活力的花粉因含有过氧化物酶使过氧化氢释放出氧，从而使花粉染成红色。生活力愈强的花粉染色愈深，不具生活力的花粉则呈黄色和无色。(3)观察和测定结果：表二花粉染色记载表供试品种花粉收集日期测定日期第一视野第二视野第三视野具有生活力的花粉(%)备注花粉总数染色总数花粉总数染色总数花粉总数染色总数每片观察三个视野，总数不少于500粒左右，统计出具有生活力的花粉粒的%。2、氯化三苯基四氮唑(简称T、T、C)染色法：具有生活力花粉的脱氢酶，在催化去氢的过程中，把氢转移到它的物质上去，使用T、T、C与催化过程中产生的氢结合，使具有生活力的花粉粒变成红色。(1)预先配制下列溶液：①磷酸盐缓冲液：在100毫升的蒸馏水中，溶解0.8323克的磷酸氢二钠(Na2HPO42H2O)和0.273克的磷酸二氢钾(KH2PO4)，调整PH值为7.17。②T、T、C溶液：称取0.02—0.05克的T、T、C溶解在10毫升的磷酸盐缓冲溶液中，溶液配好后，装入棕色滴瓶内，置于暗处。(2)操作步骤：①取少量花粉放在载玻片上，并在花粉上滴1—2滴配制液，用玻棒混合后，盖上盖玻片。②将此盖玻片置于恒温箱中(35—40℃)约15—20分钟。③在显微镜(10×10)下观察，凡具有生活力的花粉粒呈红色，部分失去生活力的呈淡红色，无色的是死的和不育的花粉粒。(3)观察和测定结果：表三花粉染色记载表供试品种花粉收集日期测定日期第一视野第二视野第三视野具有生活力的花粉(%)备注花粉总数染色总数花粉总数染色总数花粉总数染色总数6内容二蔬菜花粉生活力测定及发芽试验一、实验目的练习各种蔬菜花粉生活力测定的基本方法；了解不同蔬菜作物的花粉贮存条件对其生活力的影响。二、原理1、生活力测定将花粉用某种化学药品直接染色，根据花粉形态和染色情况判断花粉生活力有无或强弱的方法。常用的方法有I2—KI溶液染色法，氯化三苯四氮唑法(TTC)，过氧化物酶测定法等，本试验采用I2—KI溶液染色法。2、发芽试验法是将花粉播到培养基上，使其吸收水和少量营养物质，观察发芽情况，判断花粉生活力。此法是最直观可靠的。三、实验材料和用具1、试材：白菜、黄瓜、茄子等蔬菜作物的新鲜花粉或贮藏花粉。2、用具及药品：载玻片、盖玻片、显微镜、光照培养箱、镊子、培养皿、凹玻片、染色缸、培养基、I2—KI溶液等。四、实验步骤(一)生活力的测定1、采样：采集成熟的新鲜花粉或贮存过的花粉。2、染色液配制：先溶解2gKI，后加入1gI2,全部溶解后定容成100毫升，即制成含I为2%的母液，用前按需要稀释即可。3、染色：因正常花粉一般可积累比较多的淀粉，而败育花粉则不积累淀粉，利用I2—KI对淀粉的特异染色反应可区分开来，正常的花粉呈蓝黑色，败育的花粉呈黄褐色。(注：很小粒花粉视为败育)。4、统计及计算。表1花粉生活力测定记载表供试品种花粉镜检情况具生活力花粉(%)采集时间测定时间测定方法视野1视野2视野3花粉总数染色数花粉总数染色数花粉总数染色数(二)发芽力测定1、采样：采集成熟的新鲜花粉或贮存过的花粉。2、培养基制备：①成分：蔗糖10%~12%+硼酸0.01%+琼脂0.5%。②煮溶③滴定④冷却。73、播种：用解剖针等尖细物将花粉均匀地播在培养基表面(勿弄破表面)。4、培养：在25~28℃下，培养48小时。5、镜检：在10×10倍下镜检。统计结果填表2。表2花粉发芽测定记载表供试品种花粉镜检情况总发芽力(%)采集时间播粉时间蔗糖浓度视野1视野2视野3花粉总数发芽数花粉总数发芽数花粉总数发芽数实验二、园艺植物开花习性观察及有性杂交育种内容一果树的开花习性观察及有性杂交育种一、实验目的本实验通过教师讲解、现场观察、实际操作，使学生了解供试园艺植物的花器构造、开花习性并掌握有性杂交技术。二、实验方法及步骤(1)观察供试园艺植物的花器构造、开花习性。（2）确定杂交组合：根据当地的育种目标，在掌握亲本性状的遗传倾向，品种开花早晚等前提来确定杂交组合。杂交亲本的选配，原则上要符合育种目标的要求，在经济性状上做到取长补短，在组合的选配中母本更为重要，最好具备下列条件：优点较多，缺点较少的生产品种，单胚性类型或平均胚数较少的品种，父本应具有花粉生活力强，某些相对性状(如翼叶、胚的颜色)具有显性，但雄蕊退化的品种不能作父本，对于高度自花授粉的无性胚占优势的柑桔类，杂交组合宜适当增多，每杂交组合的花朵数应不少于200朵。(3)花粉采集与贮藏：父本花粉应在母本去雄前采集备用。采集花粉宜在晴天露水干后进行，一般应采含苞待放的花蕾为好，用镊子将花药取下，置于培养皿内摊开，除去花丝、标名花粉名称，放置干燥条件下直至花药开裂，散出大量花粉，然后将花粉收集在指形管内，用棉花塞好，置于干燥器内，放在低温避光的环境下保存备用。(4)母本树、花枝及花朵的选择：母本树：宜选具有该品种的典型性、丰产优质、树势中庸、抗性强的植株。花枝：一般结果母枝以春梢和早秋梢发育而成的为佳，并注意选择树冠中部外围，发育健壮的较斜生正常结果枝，但选枝还须根据品种结果习性具体而定。花朵：有叶单顶花或有叶总状花序顶部的花着果率高，无叶花序则在每一果枝上留2—5朵即将开放的正常花作为杂交用，其余花朵全部摘除。(5)去雄和套袋8母本花朵在杂交授粉前必须去雄，掌握花苞待放，花药未开裂前去雄，用镊子将花瓣剥开。然后将花药全部完整的除去，注意勿伤花柱及子房，更不能使花药破裂而引起自花授粉，去雄后为防止异花授粉，必须立即套袋隔离。当一个组合去雄完毕，所用镊子用70%酒精消毒，以便进行另一组合时再用。(6)授粉有些果树（如柑桔类）花朵的雌蕊具有早熟性，故去雄后的当天或第二天即可授粉，一般去雄后1—3天内均可授粉，最好去雄后马上授粉，可简化手续，结实率也较高，授粉最好在晴天无风的上午（9—11时）进行，授粉时用毛笔或授粉匙在指形管内沾取花粉。轻轻涂在去雄花朵的柱头上，