多聚酶链式反应扩增DNA片段

•课程标准•尝试PCR技术的基本操作和应用。•课标解读•1.理解PCR技术的基本原理。•2.知道PCR技术的基本操作过程。•3.讨论PCR技术的应用。•1．生物体内DNA分子复制的条件•(1)四种是合成子链的原料。•(2)提供了DNA复制的模板。•(3)打开了DNA双链。•(4)催化合成DNA子链。•(5)使DNA聚合酶能够从开始连接脱氧核苷酸。PCR技术的原理及反应过程脱氧核苷酸DNA母链解旋酶DNA聚合酶引物引物的3′端•2．PCR扩增的原理及条件•(1)概念•PCR即，是一种迅速的技术。它能以极少量的为模板，在短时间内复制出上百万份的。•(2)原理•①DNA的热变性：在的温度范围内，DNA双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为。当温度缓慢后，两条彼此分离的DNA链又会重新。•②子链的合成：a.需要；b.合成方向总是从子链的端向端延伸。多聚酶链式反应体外扩增DNA片段DNADNA拷贝80～100℃变性降低结合成双链引物5′3′•(3)条件•①模板。•②分别与模板DNA两条模板链相结合的两种。•③A、T、G、C四种。•④耐热DNA聚合酶，一般用。•⑤需要一定的和能严格控制的温控设备。DNA引物脱氧核苷酸耐高温的TaqDNA聚合酶缓冲溶液温度•3．PCR反应过程•PCR一般要经历次循环，每次循环可以分为、•和三步。•(1)：当温度上升到以上时，双链DNA解聚为单链。•(2)：温度下降到左右，通过与两条单链DNA结合。•(3)：温度上升到左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在•的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA•链。三十多变性复性延伸变性90℃复性50℃两种引物碱基互补配对延伸72℃DNA聚合酶•[思维激活1]DNA复制缘何必须有引物？•提示DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能以3′延伸DNA链，故DNA合成时，必须加入引物(其3′游离)以作为延长DNA子链的“引子”。•1．细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的比较(见下表)项目DNA复制PCR扩增不同点场所细胞内细胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐热的TaqDNA聚合酶是否有转录伴有转录、产生引物无转录、需加入两种引物特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30多次缓冲液不需要需要人为控制设备无需要严格控制温度变化的温控设备相同点原料四种脱氧核苷酸复制原理严格遵循碱基互补配对原则模板DNA为模板引物都需要与模板相结合的引物•2.PCR过程•(1)变性•当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。•(2)复性•温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。•(3)延伸•温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。•特别提醒(1)72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸。•(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”扩增。•【巩固1】标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()。•A．94℃、55℃、72℃B．72℃、55℃、94℃•C．55℃、94℃、72℃D．80℃、55℃、72℃•解析当温度上升到90℃(90～96℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50℃(40～60℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72℃(70～75℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。•答案A•1．实验用具•(1)PCR仪：该仪器能自动调控，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个代替，操作时按程序在3个中PCR反应的微量离心管。•(2)微量离心管：总容积为，实际上是进行的场所。•(3)微量移液器：用于。PCR技术的实验操作及评价温度恒温水浴锅水浴锅来回转移0.5mL多聚酶链式反应转移PCR配方中的液体•2．操作步骤•准备→→混合→→反应。•3．操作提示•(1)为避免等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行。•(2)所用的和应分装成小份，并在储存。•(3)在中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须。加入组分设置PCR的循环程序外源DNA高压灭菌缓冲液酶－20℃微量离心管更换•[思维激活2]PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要旋转酶吗？•提示PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但该解旋过程不是DNA解旋酶催化的结果，而是利用DNA热变性的原理，在80～100℃温度范围内，DNA双螺旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的。•1．PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸第1次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min2.PCR体外扩增DNA片段实验流程准备↓按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上移液↓用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分混合↓盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁离心↓将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在离心管底部反应将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应：变性→复性→延伸•3．实验中DNA含量的测定•DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：•①稀释：2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释•↓•②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零•↓•③测定：取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值•↓•④计算：DNA含量(μg)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数•特别提醒若没有PCR仪，可进行水浴扩增DNA•设置3个恒温水浴锅，温度分别为94℃、55℃和72℃，在3个水浴锅中依据PCR仪的处理时间来回转移PCR反应的微量离心管即可。•【巩固2】聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是()。•A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术•B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板•C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增•D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变•解析PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。•答案C•【例1】(2011江苏)请回答有关问题。•(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。PCR技术的原理•①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。•②在第______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。•(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。•①第1组：________________；②第2组：________________。•(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_________________。•思维导图：深度剖析(1)①第四轮循环，共得到16个DNA分子，其中只有1个DNA分子不含引物A，所以含引物A的DNA片段占1516。②分析可看出从第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，长度可为DNA总长度减去引物A，或者为DNA总长度减去引物B。(2)第1组引物Ⅰ和引物Ⅱ会发生碱基互补配对，第2组中引物Ⅰ′自身折叠会发生碱基互补配对。(3)DNA聚合酶的作用是将单个的脱氧核苷酸连接到双链DNA片段的引物链上。答案(1)①1516②三(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上•[归纳提升]PCR技术特点：•(1)PCR不需要解旋酶，而生物体内DNA复制时需要解旋酶；•(2)PCR需要耐热的DNA聚合酶，而生物体内DNA聚合酶在高温时会变性；•(3)PCR一般需经三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的控制。•【例2】使用PCR仪具体实验操作顺序应为()。•①设计好PCR仪的循环程序②按配方准备好各组分•③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分④进行PCR反应⑤离心使反应液集中在离心管底部•A．②③⑤④①B．①⑤③②④•C．②③⑤①④D．④②⑤③①•思维导图：PCR技术实验操作及注意事项•深度剖析PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)—移液—混合—离心—反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。•答案C