中国药典2015年版生物样品分析方法验证指导原则要点解读钟大放中国科学院上海药物研究所2015-6-27,南京第一组问题《生物样品分析方法验证指导原则》是根据什么起草的?该指导原则的适用范围是什么?生物样品分析方法验证为什么很重要?背景中国目前的生物分析方法验证指导原则-中国药典2000,2005,2010-包括在生物利用度和生物等效性试验指导原则中(只有1页内容)-CDE指导原则2005,包括在其他技术指导原则中-CDE指导原则2005,包括在其他技术指导原则中中国药典2015年版新指导原则-生物样品分析方法验证作为独立的指导原则-与发达国家的先进标准接轨(EMA,FDA)-内容比较具体(约10000字)-满足中国未来5年的需求指导原则起草过程-参考EMA和FDA指导原则-草案在期刊发表(2011)-要点在国际会议发表(2012)背景-CBF讨论和修改(2013)-制剂专业委员会通过(2014)-药典委员会征求意见(2014)-正式发布(2015-06-10)-实施(2015-12-01)中国药典2015年版,征求意见稿生物样品定量分析方法验证指导原则1.范围2.生物分析方法验证目录2.生物分析方法验证3.试验样品分析4.配体结合分析5.试验报告1.范围准确测定生物基质(如全血、血清、血浆、尿)中的药物浓度,对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性,或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此,必须完整地验证和记录应用的生物分析方法,以获得可靠的结果。本指导原则提供生物分析方法验证的要求,也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求,以及何时可以使用部分验证或交叉验证,来替代完整验证。生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。第二组问题完整验证包括哪些内容?对照标准物质有什么规定?方法的选择性有什么规定?如何估计分析物残留?如何估计分析物残留?什么是定量下限?对标准曲线有哪些规定?怎样计算方法的准确度和精密度?什么是稀释可靠性?2.生物分析方法验证2.1完整验证(色谱方法)选择性残留标准曲线准确度稀释可靠性基质效应定量下限2.2部分验证2.3交叉验证精密度稳定性2.1.1选择性该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。应该使用至少6个受试者的空白基质来证明选择性,它们被分别分析并评价干扰。动物空白基质可以不同批次混合。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%,当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%,并低于内标响应的5%时,通常即可以接受。应该考察药物代谢物、经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。在适当情况下,也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。2.1.2残留应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后,注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%,并且不超过内标的残留应不超过定量下限的20%,并且不超过内标的5%。如果残留不可避免,应考虑特殊措施,在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施,以确保不影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品,然后分析下一个试验样品。2.1.3定量下限定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度,具有可接受的准确度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点,应适用于预期的浓度和试验目的。干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%。2.1.4标准曲线应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应,获得标准曲线。通过加入已知浓度的分析物(和内标)到空白基质中,制备各浓度的校正标样,其基质应该与目标试验样品基质相同。方法验证中研究的每种分析物和每一分析批,都应该有一条标准曲线。在进行分析方法验证之前,最好应该了解预期的浓度范围。标准曲线范围应该尽量覆盖预期浓度范围,由定量下限和定量上限(校正标样的最高浓度)来决定。该范围应该足够描述分析物的药动学。应该使用至少6个校正浓度水平,不包括空白样品(不含分析物和内标的处理过的基质样品)和零浓度样品(含内标的处理过的基质)。每个校正标样可以被多次处理和分析。标准曲线(2)应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式。空白和零浓度样品结果不应参与计算标准曲线参数。应该提交标准曲线参数,测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在方法验证中,至少应该评价3条标准曲线。校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15%以内,定校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15%以内,定量下限处应该在±20%内。至少75%校正标样,含最少6个有效浓度,应满足上述标准。如果某个校正标样结果不符合这些标准,应该拒绝这一标样,不含这一标样的标准曲线应被重新评价,包括回归分析。最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线,但如果有稳定性数据支持,也可以使用预先配制并储存的校正标样。2.1.5准确度分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度,表示为:(测得值/真实值)×100%。应采用加入已知量分析物的样品来评估准确度,即质控样品。质控样品的配制应该与校正标样分开进行,使用另行配制的储备液。应该根据标准曲线分析质控样品,将获得的浓度与标示浓度对比。准确度应报告为标示值的百分比。应通过单一分析批(批内准确度)和不同分析批(批间准确度)获得质控样品值来评价准确度。为评价一个分析批中不同时间的任何趋势,推荐以质控样品分析批来证明准确度,其样品数不少于一个分析批预期的样品数。准确度(2)批内准确度-为了验证批内准确度,应取一个分析批的定量下限及低、中、高浓度质控样品,每个浓度至少用5个样品。-浓度水平覆盖标准曲线范围:定量下限,在不高于定量下限浓度3倍的低浓度质控样品,标准曲线范围中部附近的中浓度质控样品,以及标准曲线范围上限约75%处的高浓度质控样品。质控样品,以及标准曲线范围上限约75%处的高浓度质控样品。-准确度均值一般应在质控样品标示值的±15%之内,定量下限准确度应在标示值的±20%范围内。批间准确度-通过至少3个分析批,且至少两天进行,每批用定量下限以及低、中、高浓度质控样品,每个浓度至少5个测定值来评价。-准确度均值一般应在质控样品标示值的±15%范围内,对于定量下限,应在标示值的±20%范围内。2.1.6精密度分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度,定义为测量值的相对标准差(变异系数)。应使用与证明准确度相同分析批样品的结果,获得在同一批内和不同批间定量下限以及低、中、高浓度质控样品的精密度。对于验证批内精密度,至少需要一个分析批的4个浓度,4即定量下限以及低、中、高浓度,每个浓度至少5个样品。对于质控样品,批内变异系数一般不得超过15%,定量下限的变异系数不得超过20%。对于验证批间精密度,至少需要3个分析批(至少2天)的定量下限以及低、中、高浓度,每个浓度至少5个样品。对于质控样品,批间变异系数一般不得超过15%,定量下限的变异系数不得超过20%。2.1.7稀释可靠性样品稀释不应影响准确度和精密度。应该通过向基质中加入分析物至高于定量上限浓度,并用空白基质稀释该样品(每个稀释因子至少5个测定值),来证明稀释的可靠性。准确度和精密度应在±15%之内,稀释的可靠性应该覆盖试验样品所用的稀释倍数。可以通过部分方法验证来评价稀释可靠性。如果能够证明其他基质不影响精密度和准确度,也可以接受其使用。第三组问题如何确定LC-MS方法的基质效应?如何进行分析物稳定性考察?哪些情形只需要部分验证?哪些情形需要交叉验证?2.1.8基质效应当采用质谱方法时,应该考察基质效应。使用至少6批来自不同供体的空白基质,不应使用合并的基质。如果基质难以获得,则使用少于6批基质,但应该说明理由。对于每批基质,应该通过计算基质存在下的峰面积(由空白基质提取后加入分析物和内标测得),与不含基质的相应峰面积(分析物和内标的纯溶液)比值,计算每一分析物和内标的基(分析物和内标的纯溶液)比值,计算每一分析物和内标的基质因子。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子,计算经内标归一化的基质因子。从6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数不得大于15%。该测定应分别在低浓度和高浓度下进行。除正常基质外,还应关注其他样品的基质效应,例如溶血的或高血脂的血浆样品等。2.1.9稳定性必须在分析方法的每一步骤确保稳定性,用于检查稳定性的条件,例如样品基质、抗凝剂、容器材料、储存和分析条件,都应该与实际试验样品的条件相似。用文献报道的数据证明稳定性是不够的。采用低和高浓度质控样品(空白基质加入分析物至定量下限浓度3倍以内以及接近定量上限),在预处理后以及在所评价的条件储存后立即分析。条件储存后立即分析。由新鲜制备的校正标样获得标准曲线,根据标准曲线分析质控样品,将测得浓度与标示浓度相比较,每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15%范围内。应通过适当稀释,考虑到检测器的线性和测定范围,检验储备液和工作溶液的稳定性。稳定性检查应考察不同储存条件,时间尺度应不小于试验样品储存的时间。稳定性(2)通常应该进行下列稳定性考察:-分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性;-从冰箱储存条件到室温或样品处理温度,基质中分析物的冷冻和融化稳定性;-基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性;-处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳定性;-处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性。应特别关注受试者采血时,以及在储存前预处理的基质中分析物的稳定性,以确保由分析方法获得的浓度反映受试者采样时刻的分析物浓度。可能需要根据分析物的结构,按具体情况证明其稳定性。2.2部分验证在对已被验证的分析方法进行小幅改变情况下,根据改变的实质内容,可能需要部分方法验证。可能的改变包括:-生物分析方法转移到另一个实验室,-改变仪器、校正浓度范围、样品体积,-其他基质或物种,-改变抗凝剂、样品处理步骤、储存条件等。应报告所有的改变,并对重新验证或部分验证的范围说明理由。2.3交叉验证应用不同方法从一项或多项试验获得数据,或者应用同一方法从不同试验地点获得数据时,需要互相比较这些数据时,需要进行分析方法的交叉验证。如果可能,应在试验样品被分析之前进行交叉验证,同一系列质控样品或试验样品应被两种分析方法测同一系列质控样品或试验样品应被两种分析方法测定。对于质控样品,不同方法获得的平均准确度应在±15%范围内,如果放宽,应该说明理由。对于试验样品,至少67%样品测得的两组数值差异应在两者均值的±20%范围内。第四组问题试验样品分析有哪些规定?什么是分析批?分析批的接受标准是什么?如何调整校正范围?哪些情况下允许重新分析试验样品?如何进行色谱积分?试验样品再分析(ISR)有哪些规定?3.试验样品分析3.1分析批3.2分析批的接受标准3.3校正范围3.3校正范围3.4试验样品的重新分析和报告值选择3.5色谱积分3.6用于评价方法重现性的试验样品再分析3.1分析批一个分析批包括空白样品和零浓度样品,包括至少6个浓度水平的校正标样,至少3个浓度水平质控样品(低、中、高浓度双重样品,或至少试验样品总数的5%,两者中取数目更多者),以及被分析的试验样品。所有样品(校正标样、质控和试验样品)应按照它们将被分析的顺序,在同一样品批中被处理和提取。被分析的顺序,在同一样品批中被处理和提取。一个分析批包括的样品在同一时间处理,即没有时间间隔,由同一分析者相继处理,使用相同的试剂,保持一致的条件。质控样品应该分散到整个批中,以此保证整个分析批的准确度和精密度。对于生物等效性试验,建议一名受试者的全部样品在同一分析批中分析,以减少结果的变异。3.2分析批的接受标准应在分析试