HepG2细胞培养方法

HepG2细胞培养方法细胞复苏：材料：HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS（青霉素+链霉素）35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜试剂配制：100ml完全培养基：90mlRPMI-1640+10ml胎牛血清+1支PS，4℃保存步骤：1．罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。2．从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置37℃水浴1min至融化。3．打开冻存管，吸取细胞悬液至离心管，轻轻混匀。4．800rpm离心5min,弃上清。5．细胞沉淀中加入4ml完全培养基，转入35cm培养瓶37℃常规培养，第二天观察细胞生长情况。细胞传代与换液：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜试剂配制：100ml终止液：90mlRPMI-1640+10ml小牛血清+1支PS，4℃保存步骤：1．对数增长期汇合度80%-90%的细胞可以传代，4mlPBS清洗两次。2．加入0.25%胰酶1ml,37℃孵育5min。3．加入3ml终止液，吹打细胞使其脱落并单个化，再移至罗口离心管。4．离心5min,800rpm，弃上清。5．罗口离心管加入完全培养基，混匀后分瓶培养。6．细胞隔日可以用PBS清洗后更换培养基。细胞冻存：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、消毒的冻存管、水浴箱、计时器、离心机、过滤器、光学显微镜试剂的配制：10ml冻存液：7ml完全培养基+2ml胎牛血清+1mlDMSO,混匀后过滤，4℃保存步骤：1．去除培养瓶中旧的培养基，加入4mlPBS清洗两次。2．混匀胰酶，每瓶加入1ml,37℃孵育5min。3．每瓶加入3ml终止液，反复抽打细胞使其脱落并单个化，移至罗口离心管。4．800rpm离心5min,弃上清。5．每管加入1ml冻存液，混匀细胞，移至冻存管中。将细胞冻存管放于-20℃保存2hrs。6．细胞冻存管-80℃过夜。7．第二天转入液氮中保存。细胞种板：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、六孔板、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜、细胞计数器步骤：1．将汇合度为80%-90%的HepG2细胞加入4mlPBS清洗两次。2．加入1ml已混匀好的胰酶消化，37℃孵育5min。3．培养瓶中加入终止液3ml，反复吹打使其脱落并单个化，细胞悬液转移至罗口。4．800rpm离心5min,弃上清。5．加入6.5ml完全培养基，充分混匀细胞，取15ul细胞悬液进行细胞计数，要求六孔板约5*106-1*106/孔。6．将6ml细胞悬液转入六孔板，每孔1ml,轻轻摇匀悬液，使其均匀完全覆盖，37℃继续培养。软脂酸和炎症因子处理HepG2细胞：材料：RPMI-1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、甲醇、PBS、PS、软脂酸(SIGMAP9767)、TNF-a、BSA消毒的罗口离心管、消毒的吸管和EP管、过滤器、光学显微镜、测量计、过滤器试剂配制：1．BSA培养液：储存液：称取1gBSA溶于10mlRPMI-1640，混匀后过滤，4℃保存工作液：一瓶RPMI-1640加入2mlBSA储存液和一支PS,即浓度为0.2%，4℃保存2．软脂酸储存液：称取13.92mg软脂酸（分子量278.41）溶于1ml甲醇，即浓度为0.05mmol/ml，37℃水浴助溶，分为5份分装于EP管，-20℃保存3．TNF-a储存液：称取10ngTNF-a溶解于1mlPBS,及浓度为10ng/ml，分为10份分装于EP管，-20℃保存步骤：1．低倍显微镜观察六孔板里细胞状态，保证无污染，无杂质，汇合度为70%-80%的细胞才可以进行下一步实验。2．六孔板里的细胞加入1mlPBS清洗，每孔加入1ml0.2%BSA的RPMI-1640，继续无血清培养24hrs。3．不同浓度软脂酸处理细胞24hrs。（每组三个复孔）（1）对照组：用1mlPBS清洗后，每孔1mlBSA继续培养。（2）0.02mmol/Lpalmitate:1.2ul软脂酸储存液+2998.8ulBSA,每孔1ml。（3）0.04mmol/Lpalmitate:2.4ul软脂酸储存液+2997.6ulBSA,每孔1ml。（4）0.08mmol/Lpalmitate:4.8ul软脂酸储存液+2995.2ulBSA,每孔1ml。（5）0.16mmol/Lpalmitate:9.6ul软脂酸储存液+2990.4ulBSA,每孔1ml。（6）0.32mmol/Lpalmitate:19.2ul软脂酸储存液+2980.8ulBSA,每孔1ml。4．不同浓度TNF-a处理细胞24hrs。（每组三个复孔）（7）对照组：每孔1mlBSA继续培养。（8）5ng/mlTNF-a:1.5ulTNF-a储存液+2998.5ulBSA,每孔1ml。（9）10ng/mlTNF-a:3ulTNF-a储存液+2997ulBSA,每孔1ml。（10）20ng/mlTNF-a:6ulTNF-a储存液+2994ulBSA,每孔1ml。（11）40ng/mlTNF-a:12ulTNF-a储存液+2988ulBSA,每孔1ml。Trizol法提取细胞总RNA流程材料：1.RNAisoReagent:购于Taraka（货号：D312），100ml2.氯仿、异丙醇、无水乙醇：国产分析纯3.0.1%DEPC-H2O、PBS、75%乙醇4.DEPC处理的EP管、滴头、50ml离心管，5ml注射器、计算器、低温离心机、冰盒材料的去RNA酶化：1．0.1%DEPC水配好的DEPC水过夜灭活，高压蒸汽灭菌，2．EP管、滴头、离心管用0.1%DEPC水浸泡过夜，高压蒸汽灭菌，3．75%乙醇：75ml无水乙醇+25ml0.1%DEPC水。4．新购买的异丙醇分装于DEPC处理的50ml离心管，4℃保存步骤：1.吸出培养基，PBS清洗一次；2.向100ml培养瓶（6孔板中2孔）加入1mlRNAisoReagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（约30次）；将裂解液转移至1.5mlEP管，移液器反复吹打（推荐用5ml注射器抽打10次）；3.室温静置5min后加入氯仿200ul（RNAisoReagent：氯仿＝1ml:200ul），用力震荡后，室温静置5min，待分层后离心，12000g，4℃，15min；4.取80％无色上清液至另一干净1.5mlEP管（切忌吸出白色中间层），加入400ul异丙醇（异丙醇应与上清体积比为1:1），充分混匀后，静置10min；5.12000g，4℃，离心10min，此时管底可见沉淀；6.小心弃上清液，缓慢沿管壁加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒使沉淀飘起，12000g，4℃，离心5min，小心弃乙醇，可离心数秒后将残液吸走；7.室温静置2-5min，干燥RNA；8.加入DEPC-H2O30或40ul溶解RNA，-80℃保存。RNA浓度的标化：吸取4ulRNA+196ulDEPC水稀释50倍在分光光度计上测算样品的浓度，记好A260、Con(ug/ml)和A260/A280，原始浓度为测量浓度*50（A260和Con换算为Con:A260=40,A260/A280为1.6-2.0，线性范围最好），标化的方法是以最低浓度的一个样品为标准进行标化，标化10ulRNA,计算各个样品加DEPC水量，做RT时RNA加样量为X（0.5ug/原始浓度*1000）ul。RT-PCR材料：逆转录试剂盒（TAKARADRR047A）、PCR试剂盒（TAKARADRR081A）PCR水（灭菌蒸馏水）、去RNA酶的200ul离心管、PCR8连管、计时器、水浴箱逆转录反应体系为20ul（1）基因组DNA的除去反应。5*gDNAEraserBuffer2ulgDNAEraser1ulRNaseFreedH2O(10-2-1-X)ulTotalRNAXul42℃2min水浴，4℃保存（2）反转录反应。5*PrimeScriptBuffer24ulPrimerScriptRTEnzymeMIX11ulRTPrimerMIX41ulRNaseFreedH2O4ul37℃15min→→85℃5sec（PCR仪反应，约16min，迅速转入－20℃保存）PCR反应体系为25ulSYBRPremixEXTaqⅡ12.5ul上游引物0.25ul下游引物0.25ulPCR水10ulcDNA2ul*无论做RT还是PCR应先将按样品数计算每种试剂加入量，配在一管里面混匀后加入每个反应管里面，再加各个管的RNA或cDNA,为了保证每管加量完全，可以多配1-2样品的试剂量，混匀加入每管。*考虑到做PCR时检测具体基因数不同，反应体系可以以倍数的改变，如P两个基因，RT时可以做6ul体系，即每个试剂加入量均*0.3，混匀后加入每管。*加入RT后cDNA2ul,注意加样量一致，改好盖子，在盖子一端的边缘做好标记，弹去反应液里面的空气，离心。