免疫细胞的分离与功能测定

免疫细胞的分离与功能测定一外周血单个核细胞的分离原理:密度梯度离心，利用密度为1.077±0.001g/L淋巴细胞分层液（聚蔗糖-泛影葡胺）FicollFicoll分离液法分离液法血浆淋巴细胞分离液粒细胞红细胞2000r/min20minFicollFicoll分离液法分离液法血浆淋巴细胞分离液粒细胞红细胞2000r/min20min主要步骤1无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml125～250U/ml肝素溶液）2用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.2～7.4PBS稀释3按每10ml稀释血用3～5ml淋巴细胞分层液的比例先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液42000r/min水平离心30min，5吸取分层液与血浆交界部位的单个核细胞，用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000r/min，1500r/min离心10min6用完全RPMI-1640定容，计数。一般每ml健康成人血可分离出1×106～2×106单个核细胞7台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应﹥95﹪。注意事项1严格无菌操作2操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀3淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后待温度升至室温使用4如须保存血浆作他用，则不能稀释血液5离心最适温度18～20℃6分离组织中的单个核细胞也可采用上法二淋巴细胞的纯化㈠红细胞的去除1低渗裂解法1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（﹤1min）立即加入1.8﹪NaCl,洗涤2氯化铵处理法沉淀的PBMC中加入1ml0.83﹪氯化铵溶液，轻摇2min，洗涤㈡血小板的去除1.PBMC经洗涤2～3次可去除大部分血小板2.胎牛血清(FCS)梯度离心1mlPBMC悬液（1×107～2×107/ml）用3mlFCS800r/min水平离心15min，18～20℃㈢单核细胞的去除1.粘附去除法原理单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面⑴PBMC用完全RPMI-1640调整浓度至2×106/ml⑵将50ml细胞悬液移入150cm2培养瓶，37℃5﹪CO295﹪湿度培养1h⑶收集非粘附细胞，再用预温至37℃的RPMI-1640,轻轻荡洗培养瓶并收集荡洗液⑷1300r/min离心10min，18～20℃⑸弃上清，用5～10ml完全RPMI-1640悬浮细胞计数，用台盼蓝染色检查细胞活性2.L-亮氨酸甲酯去除法溶酶体酶→L-亮氨酸甲酯→L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯此法也可清楚NK细胞和细胞毒性T细胞本法只适用于分离新鲜细胞⑴用PBS调整细胞浓度至3×1065×106/ml，用无血清RPMI-1640配制10mmol/L的L-亮氨酸甲酯溶液（临用时配），两液按1︰1比例混合，室温40min⑵1300r/min离心10min，用HBSS或PBS洗涤沉淀共3次⑶用完全RPMI-1640悬浮细胞，用无菌尼龙网过滤，离心并计数，调整细胞至所需浓度3.羰基铁吞噬离心法在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37℃搅拌15min，然后用淋巴细胞分层液离心分离亦可先分离PBMC，再加羰基铁粉分离去除单核细胞粘附法去除单核细胞后，大约95﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪L-亮氨酸甲酯法，99﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪三外周血淋巴细胞选择性分离㈠T细胞的分离1.尼龙棉柱法原理B细胞易粘附于尼龙棉纤维，而T细胞则否尼龙棉（聚酰胺纤维）预处理尼龙棉（聚酰胺纤维）50mg在0.2mol/LHCl浸泡过夜，用大量蒸溜水漂洗，晾干。尼龙棉柱制备塑料软管长12～16cm内经5～6mm壁厚0.2mm高6cm的尼龙棉柱可有效地滤过20×106～30×106个细胞.此法分离的T细胞纯度可达90﹪以上2.花环形成分离法原理T细胞表面有绵羊红细胞受体，可与绵羊红细胞结合形成花环.绵羊红细胞用2-氨基乙基异硫脲溴化物（AET）或神经氨酸酶（NM）可提高花环形成的效果和稳定性⑴1mlPBMC悬液(1×107/ml)、2mlNCS和1ml4﹪AET-SRBC悬液混匀，37℃水浴10min↓800r/min4℃离心5min，冰浴1h或800r/min室温离心10min，4℃2h↓置淋巴细胞分层液（3～5ml分层液可分离10mlPBMC/NCS/AET-SRBC混合液）↓1300r/min离心25min，18～20℃或2000r/min离心35min，4℃位于界面的是非花环形成细胞，沉淀的是花环形成细胞⑵1mlPBMC悬液(1×107/ml)、2mlNCS和2ml2﹪NM-SRBC悬液混匀，37℃水浴10min以下步骤同⑴经1次花环形成试验所得到的花环形成细胞中，T细胞﹥95﹪，B细胞﹤1﹪，单核细胞约为2﹪。经2次花环形成试验后，非花环形成细胞中T细胞﹤2﹪用此法时，因SRBC与受体结合可激活某些T细胞，导致功能增强㈡T细胞亚群的分离1.间接免疫吸附分离法原理T细胞+抗某种T细胞分化抗原的抗体↓加入包被有羊抗鼠Ig的平皿2.抗体/补体介导的细胞毒作用分离法原理是一种负性分离法T细胞+抗某种需去除T细胞分化抗原的抗体+补体→该亚群T细胞裂解如T细胞+抗CD4抗体+补体→CD4+细胞裂解T细胞+抗CD8抗体+补体→CD8+细胞裂解3.免疫磁性微珠分离法原理羊抗鼠Ig+磁性微珠→免疫磁性微珠T细胞+抗某种亚群分化抗原的抗体↓加免疫磁性微珠↓在外加磁场作用下，该亚群T细胞连同免疫磁性微珠一起沉降如T细胞+抗CD4抗体↓加免疫磁性微珠↓在外加磁场作用下，CD4+T细胞连同免疫磁性微珠一起沉降，CD8+T细胞则留在悬液中优点细胞纯度高，产量大，操作简单㈢B细胞的分离1.负性B细胞分离法⑴用密度梯度离心法分离PBMC⑵用L-亮氨酸甲酯法去除单核细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞⑶用花环形成法去除T细胞用此法分离B细胞，240ml全血中可得1×107～2×107个B细胞，纯度﹥90﹪，2﹪～3﹪的单核细胞，﹤1﹪的其他细胞2.直接免疫吸附法兔抗人Ig包被平皿↓淋巴细胞悬液↓洗去未吸附细胞，收集吸附细胞3.间接免疫吸附法淋巴细胞悬液+抗CD19、抗CD20抗体↓羊抗鼠Ig包被的平皿↓洗去未吸附细胞，收集吸附细胞4.免疫磁性微珠分离法㈣NK细胞的分离1.负性NK细胞分离法⑴用密度梯度离心法分离PBMC⑵用粘附法去除单核细胞⑶用尼龙棉柱法去除B细胞⑷用花环形成法去除T细胞2.免疫磁性微珠分离法，抗CD16抗体四淋巴细胞亚群的检测㈠免疫荧光技术直接法FITC-抗CD4抗体FITC-抗CD8抗体间接法FITC-羊抗鼠Ig抗CD4抗体抗CD8抗体㈡微量细胞毒试验PBMC+抗某亚群T细胞分化抗原的抗体+补体↓加染料，该某亚群T细胞着色如T细胞+抗CD4抗体+补体↓加伊红染料，呈红色的为CD4+细胞㈢花环技术1葡萄球菌花环法原理SPA可与IgGFc段结合直接SPA菌花环法SPA菌-抗CD3、SPA菌-抗CD4、SPA菌-抗CD8间接SPA菌花环法SPA菌-兔抗鼠Ig（IgG类）抗CD3、抗CD4、抗CD82红细胞花环法原理将SRBC与mAb或兔抗鼠IgG偶联直接红细胞花环法SRBC-抗CD3、SRBC-抗CD4、SRBC-抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率间接红细胞花环法抗CD3、抗CD4、抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，加入SRBC-兔抗鼠IgG偶联物作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率五淋巴细胞功能测定㈠淋巴细胞增殖试验非特异性刺激物PHA、ConA、PWM、SPA、LPS，胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白质，抗CD2、抗CD3、抗IgM等细胞表面标志的抗体，及某些细胞因子特异性刺激物特异性抗原1.丝裂原刺激的淋巴细胞增殖试验丝裂原→淋巴细胞→淋巴母细胞⑴3H-TdR掺入试验SI﹦试验组cpm/对照组cpm⑵形态学方法结果以淋巴细胞转化率表示⑶MTT比色法琥珀酸脱氢酶→MTT→甲月赞+盐酸异丙醇或二甲基亚砜→溶解后测OD值SI﹦试验组OD均值/对照组OD均值2.混合淋巴细胞培养单向混合淋巴细胞培养双向混合淋巴细胞培养可分3H-TdR掺入法、形态学方法及MTT比色法3.自身混合淋巴细胞反应4.淋巴因子诱导的细胞增殖反应如IL-4→B细胞，IL-2→T细胞5.影响细胞增殖反应的因素⑴细胞应保持高活性，⑵可溶性抗原刺激淋巴细胞增殖时，常需一定数量的抗原呈递细胞⑶不同的刺激原有不同的刺激剂量⑷严格无菌操作六NK细胞活性测定靶细胞人NK细胞K562细胞（靶细胞）鼠NK细胞YAC-1细胞（靶细胞）㈠形态学方法原理靶细胞被NK细胞杀伤后细胞膜通透性改变而使台盼蓝染料透入细胞，细胞呈蓝色，无折光性靶细胞K562细胞或YAC-1细胞用完全RPMI-1640调整细胞浓度为2×105/ml效应细胞人PBMC或小鼠脾细胞用含15﹪NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为1×107/ml对照孔100ul靶细胞＋100ul完全RPMI-1640实验孔100ul靶细胞＋100ul效应细胞效/靶细胞比例（E/T）为50︰1各设3个平行空，37℃5﹪CO2温箱培养过夜每孔各取30ul细胞悬液，加30ul0.5﹪台盼蓝室温染色5min于白细胞计数板中每孔各计数100个细胞，记录死细胞及活细胞数，求出各组NK细胞活性的均值实验组靶细胞死亡数－对照组靶细胞死亡数NK细胞活性%﹦100100﹪×㈡同位素释放法1.51Cr释放试验2.125I-UdR释放试验3.全血NK细胞活性同位素检测法七单核-巨噬细胞的分离与功能测定㈠人单核细胞的分离方法单核细胞占外周血白细胞的3﹪～5﹪1Peroll离心沉淀法Peroll（聚乙烯吡咯酮包被的硅胶混悬液）Peroll连续密度梯度液配制Peroll7ml和2×PBS6ml→1500r/min离心40min操作步骤PBMC加到3～5mlNCS上↓800r/min，离心15min（18～20℃）↓沉淀细胞用含10﹪NCS的PBS配制成2×107～5×107/ml悬液↓加到Peroll连续密度梯度液，4℃2400r/min离心20min↓出现4个细胞层，吸取第二层细胞（单核细胞占70﹪～90﹪），洗涤后计数，配制成所需浓度2粘附法用EDTA抗凝血制备PBMC，用DEME液将PBMC配制成2×106/ml悬液，加入培养瓶（75cm2瓶加10ml细胞悬液）↓37℃5﹪CO2温箱1h↓用DEME液洗涤2次，洗去非粘附细胞↓用细胞刮片刮下细胞，或加入0.2﹪EDTA/PBS，10min后收集细胞，↓1500r/min离心10min,配制细胞悬液，计数并调整至所需浓度3Colotta法用PBS5倍稀释的肝素抗凝血20ml，加在20ml淋巴细胞分层液上↓2000r/min离心20min室温,吸取PBMC用PBS洗涤两次，500r/min离心10min↓弃上清，沉淀中加入5ml含10﹪NCS，25mmol/LHEPES的RPMI-1640培养液↓加在5ml46﹪Percoll液中↓2200r/min离心30min室温，得到3个带，第一带为富含单核细胞层（83﹪），第二带含少量单核细胞，第三带为淋巴细胞↓吸出，洗涤，计数并调整至所需浓度㈡单核-巨噬细胞功能测定1单核-巨噬细胞趋化试验2巨噬细胞吞噬功能测定⑴人体巨噬细胞的获取①用1cm2大小滤纸蘸满10﹪斑蝥酊置于前臂皮肤②4～5h后可见局部皮肤发红③48h后局部形成水疱④无菌吸取水疱液,一般可吸1～2ml,最多可吸8ml,巨噬细胞平均为30﹪～40﹪,最多可达80﹪