固定化小球藻培养条件的实验研究

固定化小球藻培养条件的实验研究摘要：本文为固定化小球藻培养条件的实验研究。采用细胞固定化的方法，选取五种培养液固定化培养小球藻，用紫外分光光度计在470nm的紫外可见光下定期测量其培养液的pH值和叶绿素含量，分析数据，从而得出培养小球藻的最适条件和培养液。实验结果表明培养小球藻的最适pH在4.5-5.4之间。海藻肥培养液为最适合的培养液关键词：小球藻、固定化、叶绿素、含量、测定前言微藻生物技术属于生命科学研究领域的一个重要分支，是目前国内外的研究热点和前沿。小球藻是人类最早分离培养的一种绿藻，属于具有真核细胞的最简单光合作用有机体，小球藻生息在淡水中，它借助阳光、水和二氧化碳，以每隔20小时分裂出4个细胞的旺盛繁殖能力，不停地将太阳能量转化生成蕴涵多种营养成分的藻体，并在增值中释放出大量的氧气；而它的光合能力高于其他植物10倍以上。基于这种生命活力及产生的高能营养物质，人们赞美它是“罐装的太阳”。有望成为减排C02的先锋物种。小球藻的固定化即将小球藻与海藻酸钠溶液混合，在CaCl2的作用下形成固体小球。此包埋制得的小球体可使其内的小球藻有较好的机械性能和防破坏能力而周围营养源可与其内的藻体进行正常接触。但是，固定化小球藻的培养条件和生长情况报道很少，本实验首先固定化小球藻，然后在不同的液体营养环境中培养，定期测量其培养液的pH值和叶绿素含量，分析数据，从而得出培养小球藻的最适条件和培养液，为固定化小球藻的利用提供基础数据。1材料与方法：1.1实验仪器：超净工作台、高压蒸汽箱、分光光度计、试管、电子秤、移液管、量筒、烧杯1.2配制药品溶液配制五种培养液各200ml1号SE溶液（药品加蒸馏水）2号（土壤浸出液）用水浴加热土壤水溶液过滤。3号（硝酸钠60mg/L,尿素1.8mg/L,磷酸二氢钾2mg/L)，4号复合肥溶液l5号海藻肥配制固定化小球藻试剂4%海藻酸钠200ml，5%氯化钙溶液2000ml以上溶液均加入高压蒸汽箱灭菌。灭菌半个小时。灭菌完后，1号、2号、3号、4号、5号溶液和氯化钙溶液均放入冰箱中保存。1.3试验方法1.3.1固定化小球藻在超净工作台打开的情况下打开紫外灯对工作台灭菌处理约20分钟并用沾有医用酒精的棉球擦拭双手和工作台面（起灭菌效果）将经过灭菌处理过的海藻酸钠溶液和Cacl2溶液取出，从锥形瓶中取出15ml海藻酸钠溶液与绿藻溶液置于小烧杯中，用干净的注射器抽取混合溶液再放出，重复几次此动作使液体尽量充分地混合均匀，再将带有针头的注射器吸取大约5毫升的混合液，慢慢的一滴滴的滴向Cacl2溶液中，可看到有固体透明球体生成，重复此过程直到将混合液用尽分别在五个烧杯中重复步骤（2）得到五组固定化小球藻静置大约2小时后分别向烧杯中加入无菌蒸馏水使其分别稀释一倍最后将大烧杯放入冰箱内静止过夜。1.3.2固定化小球藻的培养将经过冰箱静置的五组小球藻培养液分别取出放入各个装有灭菌过的培养液的锥形瓶内，盖上牛皮纸放在阳光充足的阳台上使其自然生长并定期对其生长情况进行观察，对球体成分和培养液检测1.3.3固定化小球藻生长情况的测定1.3.3.1培养液pH的测定检测培养液的PH值定期用玻璃棒蘸取培养液滴在PH试纸上检测其PH值固定化小球藻叶绿素含量的测定1.3.3.2小球藻的叶绿素含量固定化小球藻0.2g,95%乙醇提取液5ml,分光光度计723型取5支试管，编号为1-5号，分别加入0.2g固定化小球藻和95%乙醇提取液5ml,加入之前先把小球藻用玻璃棒搅碎，用软口膜封住试管口。静置30分钟，取其上清液在分光光度计下测定其吸光度值（分别测定其在波长为649nm和665nm处的吸光度值A649,A665）,以此来计算叶绿素a，叶绿素b和总的叶绿素含量（mg/L）2实验结果与分析2.1固定化小球藻在培养过程中PH的变化一号瓶培养液pH呈逐渐降低趋势，二号瓶培养液pH呈逐渐升高趋势，三号瓶培养液pH先升高又降低趋势，四号瓶培养液pH呈逐渐升高趋势，五号培养液pH基本保持不变。五号瓶培养液pH在小球藻生长过程中比较稳定，其他的培养液pH都呈现不同的变化因此从pH的变化可以观察出五号瓶培养液最适合小球藻生长培养液的pH值变化11112222333344445555012345611月5日11月17日11月18日12月1日pH12345小球藻的pH值变化012345612345培养液pH11月5日11月17日11月18日12月1日。2.2不同培养液对固定化小球藻生长的影响从计算所得的五种培养液中培养的小球藻的叶绿素含量可知：一号瓶的叶绿素含量忽高忽低，可能与阳光照射有关；二号瓶的叶绿素含量呈逐渐降低的趋势，说明该瓶内小球藻生长状况不好；三号瓶的叶绿素含量一开始最多，然后又逐渐降低；四号瓶的叶绿素含量始终趋于稳定，说明瓶内的小球藻生长状况一般，但是不是很有活力；五号瓶的叶绿素含量最多，而且呈逐渐升高的趋势，说明该瓶内的小球藻生命力旺盛，最适合小球藻生长。五种培养液的小球藻在不同时期叶绿素变化1111222233334444555500.511.5211月5日11月17日11月18日12月1日叶绿素含量00.511.522.533.5412345五种培养瓶夜中小球藻的叶绿素含量11月5日111月5日211月5日311月5日411月5日511月17日111月17日211月17日311月17日411月17日511月18日111月18日211月18日311月18日411月18日512月1日112月1日212月1日312月1日412月1日500.511.522.533.5412345培养液叶绿素含量11月5日11月17日11月18日12月1日综合以上两点，可以得出五号培养瓶最适合固定化小球藻的生长。3实验记录：10月5日用pH试纸测定结果：1号5.12号4.83号4.64号4.55号5.4波长649nm处123450.010A0.006A0.009A0.012A0.023A波长665nm处123450.014A0.008A0.011A0.017A0.041A10月15日再次测小球藻培养液的pH和小球藻的吸光度值。方法不变用pH试纸测定结果：1号4.82号5.13号5.34号4.65号5.4波长649nm处123450.003A0.006A0.004A0.015A0.050A波长665nm处123450.004A0.006A0.007A0.026A0.089A10月17日用pH试纸测定结果：1号4.82号5.23号5.14号4.75号5.4波长649nm处123450.003A0.006A0.004A0.015A0.050A波长665nm处123450.004A0.006A0.007A0.026A0.089A10月18日用pH试纸测定结果：1号4.72号5.23号5.14号4.75号5.4波长649nm处123450.009A0.003A0.006A0.012A0.068A波长665nm处123450.007A0.003A0.007A0.022A0.119A12月1日用pH试纸测定结果：1号4.62号5.03号4.64号4.65号5.4波长649nm处123450.022A0.004A0.018A0.013A0.126A波长665nm处123450.024A0.005A0.020A0.018A0.178A根据所测吸光度值和测定植物叶绿素含量的公式计算出小球藻的叶绿素A和叶绿素B的含量以及总叶绿素含量。{其中C叶绿素a=13.95A665-6.88A649C叶绿素b=24.96A649-7.32A665总叶绿素浓度（mg/L）=C叶绿素a+C叶绿素b}日期试管号PH值（mg/L）649nm处的吸光度665nm处的吸光度C叶绿素a（mg/L）C叶绿素b（mg/L）总叶绿素（mg/L）11月5日1号5.10.0100.0140.126500.147120.273622号4.80.0060.0060.033660.155780.189443号4.60.0090.1101.472580.144121.616704号4.50.0120.1700.154590.175080.329675号5.40.0230.0410.113710.273960.3876711月17日1号4.80.0030.0040.035160.045600.080762号5.10.0060.0060.042420.105840.148263号5.30.0040.0070.070130.048600.118734号4.60.0150.0260.259500.184080.443585号5.40.0500.0890.897550.596521.4940711月18日1号4.80.0090.0090.063630.158760.222392号5.20.0030.0030.021210.052920.074133号5.10.0060.0070.056370.098520.154894号4.70.0120.0220.224340.138480.362825号5.40.0630.1191.226610.701401.9280112月1日1号4.60.0220.0240.183440.373440.556882号5.00.0040.0050.042230.063240.105473号4.60.0180.0200.155160.302880.458044号4.60.0130.0180.161660.192720.354385号5.40.1260.1781.616221.842003.45822展望近年来，全球的二氧化碳排放量越来越严重，如何降低其排放量成为热议的话题。而小球藻属于具有真核细胞的最简单光合作用有机体，生息在淡水中，借助阳光、水和二氧化碳，不停地将太阳能量转化生成蕴涵多种营养成分的藻体，并在增值中释放出大量的氧气；而它的光合能力高于其他植物10倍以上。有望成为减排C02的先锋物种。国内至少已有十几个地方将开发小球藻养殖作为一种新产业。因此培养小球藻的试验方法的前景将不可估量。