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菠菜色素的提取和色素分离曾丽兰（山西大学化学化工学院山西太原030006）摘要：在用抽滤法提取色素的过程中，由于抽滤时不好控制，非极性溶剂难免会被抽去，且在几次转移中损失较多，程序繁杂．用浸泡法操作简便易行，损失少，产率高。故在实验中采取了浸泡法提取色素，使用薄层色谱、柱色谱对叶绿素、胡萝卜素和叶黄素进行了分离。薄层层析时使用了石油醚-丙酮=8:2，石油醚-乙酸乙酯=6:4的两种不同展开剂，对比展开效果。在柱层析时，用不同洗脱剂分离得到不同物质，结果证明石油醚-丙酮=9:1做洗脱剂分离胡萝卜素效果最好。将得到的胡萝卜素进行紫外光谱测定，检验实验成果。关键词：菠菜色素；提取；分离;胡萝卜素；紫外光谱测定绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg))，差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂，也是食用的绿色色素，可用于糕点、饮料水等中，添加于胶姆糖中还可消除口臭。植物中a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于石油醚等一些非极性溶剂。胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体α—，β—,和γ—胡萝卜素，其中β—异构体含量最多，也最重要。生长期较长的绿色植物中，异构体中β—的含量多达90％。β—具有维生素A的生理活性，其结构是两分子维生素A在链端失去两分子水结合而成。生物体内，β—体受酶催化氧化即形成维生素A。目前，β—体可作为维生素A使用，也可作为食品工业的色素，β一胡萝卜素还有防癌功能。叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，在光合作用中能起收集光能的作用。在绿叶中通常是胡萝卜素的两倍。较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。由此可见，叶绿素等天然色素有广泛的用途，对于色素的提取与分离就显得很重要了．本实验就提取和分离做了相关的研究。NNNNMgCO2CH3CH2OCHH3CH3CRCH2CH3CH3CH2CH2COOCH3CH3CH3CH3CH3叶绿素a(R=CH3)叶绿素b(R=CHO)1实验部分1.1仪器与试剂仪器：研钵、分液漏斗、显微载玻片、毛细管、层析柱(20×10cm)、UV-240紫外分光光度计试剂：石油醚、乙醇(95%)、菠菜叶、丙酮(化学纯)、乙酸乙酯(化学纯)、无水硫酸钠、硅胶G、中性氧化铝(150目～160目)1.2提取与分离1.2.1浸泡法提取色素在研钵中放入10g新鲜的菠菜叶，加入20mL3：2(体积比)石油醚—乙醇混合液，适当研磨(不要研成糊状，否则会给分离造成困难)，用倾析法将提取液转移到分液漏斗中，每次用10ml水洗涤两次,以除去萃取液中的乙醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防乳化。弃去水乙醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥，干燥后滤入小圆底烧瓶，在水浴上蒸发浓缩至大约lmL。1.2.2薄层层析取四块显微载玻片，硅胶G经0.5％羧甲基纤维素钠调制后制板，在室温下晾干后在110°C活化1h。选取效果最好的一块进行点样。展开剂：（1）石油醚—丙酮=8:2（体积比）（2）石油醚—乙酸乙酯=6:4（体积比）取活化后的层析板，点样，放入预先选定展开剂的广口瓶。瓶的内壁贴一张高5cm，绕周长4／5的滤纸，下部浸入展开剂中，盖上瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，晾干，做出标记。分别用两种展开剂展开，比较不同展开剂的展开效果。观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的Rf值的大小。注意更换展开剂时，需干燥层析瓶，不允许前一种展开剂带入后一系统。1.2.3柱层析取少量脱脂棉在小烧杯中用石油醚浸润后，挤压除去气泡，放在层析柱底部。在层析柱中加15cm石油醚。加入中性氧化铝8克，打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，氧化铝在柱子中堆积。装完后，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面剩下1—2mm高为止（不能使氧化铝表面露出液面）。将浓缩液用滴管加到柱顶部，打开下端活塞，让液面下降到柱面以下1mm,关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，几次反复，使色素全部进入柱体。在柱顶加1.5cm洗脱剂——9：1（体积比）石油醚—丙酮。打开活塞，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，即胡萝卜素。1．3β—胡萝卜素的紫外光谱鉴定将橙黄色试样稀释后加到1cm的比色皿中，以石油醚做空白试剂，用分光光度计测定400—600nm范围内的吸收，指出测定的λmax值。2.结果与讨论2.1提取由于甲醇与乙醇的极性相近，但是乙醇易得、无毒，所以用3：2的石油醚一乙醇通过浸泡的方法提取菠菜色素，而不是用石油醚—甲醇。2.2分离薄层层析CH3H3CRCH3CH3CH3CH3CH3RH3CCH3H3Cß-胡萝卜素(R=H)叶黄素(R=OH)薄层层析又叫薄层色谱，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，可以用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离。实验中涉及的菠菜色素的比移值(Rf)（薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值）列表如下菠菜色素的比移值(Rf)展开剂体积比胡萝卜素叶绿素叶黄素石油醚一丙酮8：2O．820.270.44石油醚一乙酸乙酯6：40.960.780.85在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。菠菜色素中各种色素的比移值Rf大小为：胡萝b素叶黄素叶绿素，按此顺序它们的非极性依次减弱。物质极性的判断为柱层析中洗脱剂的选择提供了参考价值。柱层析胡萝卜素极性最小，因此胡萝卜素的洗脱剂用极性较小的9：l的石油醚-丙酮溶剂效果较好。但要收集其他几种色素得换用其他的洗脱剂，因为色素的极性各不相同，且有一定差别。如用7：3石油醚-丙酮分离叶黄素．分离出胡萝卜素和叶黄素后，可加大溶剂极性以较快速度洗脱叶绿素．用3：1：1的丁醇-乙醇-水洗脱剂洗脱叶绿素。2.3紫外光谱测定胡萝卜素的参考数据为481(123027)，453(141254)，实验所测数据与此有差距，可能是系统误差所导致。有关紫外光谱情况见紫外光谱如下3.结论采用浸泡法提取色素比抽滤法更好。在薄层层析时，用石油醚-丙酮=8:2时，能更明显的看到分层。在柱色谱洗脱剂的选择上，基于薄层分析的极性判断选择了石油醚-丙酮=9:1的溶剂作为洗脱剂，取得了非常好的效果。通过实验，进一步认识到洗脱剂在柱层析中的重要性。参考文献：1.兰州大学、复旦大学化学系有机化学教研室．有机化学实验(第2版)I-M3．北京：高等教育出版社，19942.王福来．有机化学实验[M]．武汉：武汉大学出版社，2001AbstractandSeparateofSpinachPigmentZengLi-lan(SchoolofChemistryandChemicalEngineeringrShanxiUniversity，Taiyuan030006，China)[Abstract]Pigmentwasabstractedfromtheleavesofspinach．ThechorophyllcaroteneandxanthophyllwereseparatedbyusingTLCandColumnChromatography．Itwasfoundthatthepetroleumether—ethanol(3：2)immersedmethodisagoodmethodandtheselectionofwashingagentisthekeyofseparatingthepigment．[Keywords]extract；separate；ultraviolet；spinachpigment基础有机化学实验菠菜色素的提取和色素分离