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I石油污染土壤的微生物修复技术摘要：石油是现代工业的重要能源，但各种泄露事故造成越来越严重的环境污染，并且石油对土壤的污染有着与独特的特征。解决土壤石油污染的方法有物理修复、化学修复和生物修复，其中石油污染土壤的微生物修复技术以其高效、环保等优点备受关注。选择具有高效降解能力的微生物是治理石油污染的关键环节，目前主要集中在土著微生物的分离筛选、构建高效降解能力的微生物菌群、以及构建基因工程菌。生物强化技术是通过接种高效降解菌株(群)或增加营养盐、表面活性剂等方式提高微生物代谢活动以去除污染物的过程。石油污染土壤的微生物修复技术已经被用于工程实践，按修复的地点又可分为原位生物修复和异位生物修复。本文在最后对石油污染土壤的微生物修复技术进行了展望。关键词：石油污染土壤，微生物，修复技术IIBioremediationTechnologyofSoilContaminatedbyPetroleumAbstract：Oilistheimportantmodernindustrialenergy,butavarietyofleakcausedseriousenvironmentalpollution,andoilpollutionofthesoilhasits’uniquecharacteristics.Tosolvetheoilcontaminationinsoil,physicalrepair、chemicalremediationandbioremediationhaveapplied,microbialremediationofpetroleumcontaminatedsoilwithitshighefficiency、environmentalprotectionandotheradvantagesofconcern.Effectivelydegrademicroorganismsarethekeyaspectsofthetreatmentofoilpollution,mainlyconcentratedintheindigenousmicrobialscreening,constructingofmicroorganismflorawithhighefficiencydegradation,andconstructinggeneticengineeringbacteria.Bioaugmentationtechnologyisefficientdegradationbyvaccinationstrains(group)ortoincreasethenutrient,asurfaceactiveagenttoimprovethemicrobialmetabolicactivitytoremovepollutantsintheprocess.Microbialremediationofpetroleumcontaminatedsoilhasbeenusedinengineeringpractice,accordingtothelocationoftherepair,itcanbedividedintoinsitubioremediationandectopicbioremediation.Articleinlastprospectmicrobialremediationofpetroleumcontaminatedsoil.Keywords:Soilcontaminatedbypetroleum，Microorganism，remediationtechnology1一、石油污染土壤特征1.1土壤污染土壤污染是指人类活动所产生的物质(污染物)，通过多种途径进入土壤生态系统，其数量和速度超过了土壤容纳的能力和土壤净化速度的现象。土壤污染可使土壤的性质、组成及性状等发生变化，使污染物质的积累过程逐渐占据优势，破坏土壤的自然动态平衡，从而导致土壤正常功能失调，土壤质量恶化，影响作物的生长发育，造成产量和质量的下降，并可通过食物链引起对生物和人类的危害，甚至形成对生命系统的超地方性的危害[1]。由于土壤的污染源十分复杂，所以土壤污染物的种类也极为繁多。通常将进入土壤中并影响土壤正常作用的物质，即会改变土壤的成分、降低农作物的数量或质量、有害于人体健康的那些物质，统称为土壤污染物。按污染物性质大致可分为：①有机污染物，主要是化学农药、除虫剂、石油、多环芳烃等；②重金属．主要是汞、锅、铅、砷、铜、锌、钻、镍、硒等；③放射性物质，主要是铂、铝、铀等；④垃圾和其他废弃物；⑤病原微生物。1.2石油污染土壤的特征与危害石油素有“工业血液”之称，是现代工业的重要能源之一。然而，随着石油使用量的增加，在石油勘探、开采、运输和储存过程中，由各种泄露事故造成的环境污染越来越严重[2]。据有关资料显示，全世界每年有近800万t石油污染物进入环境，我国每年约有60万t石油污染物进入环境[3]。这些污染物通过各种途径进入土壤，降低土壤透气性，改变土壤养分组成和结构，影响土壤微生物群落结构，减少作物产量[4-7]。污染土壤中石油主要成分为C15~C36的烷烃多环芳香烃烯烃苯系物酚类等，其中环境优先控制污染物多达30种[8]。石油对土壤的污染有着与其它土壤污染不同的特征，石油流入土壤灌满一定深度土壤空隙，影响土壤的通透性，改变土壤有机质的组成和结构，影响土壤中微生物的生长，也影响土壤中植物根系的呼吸及水分养料的吸收，甚至使植物根系腐烂坏死，严重危害植物的生长。且土壤中的石油随土壤中水的运行而运行不断地扩散到它处或深处。此外，因为石油富含反应基，能与无机氮、磷结合并限2制硝化作用和脱磷酸作用，从而使土壤有机氮、磷的含量减少，影响作物的营养吸收。石油是混合物，其中烃不易被土壤吸附的部分能渗入地下水、污染地下水，导致地下水水质恶化。石油中的某些苯系物质和多环芳烃具有致癌、致病变和致畸形等作用。这些污染土壤中的物质，经食物链的传递进入人体，在人体中积累，当积累的量达到人体所能承受的最大程度时，则严重危及人体的身体健康甚至危害生命。二、微生物降解石油烃的特点及机理2.1原油污染土壤的生物修复技术污染土壤的生物修复技术是指利用特定的生物（植物、动物微生物）吸收、转化降解或清除环境污染物，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施。生物修复技术已成为生态环境保护领域最有价值和最具生命力的处理技术之一，被美国国家环保局（USEPA）推荐作为原油污染土壤修复的首选措施[9]。1989年石油公司的油轮在阿拉斯加海湾发生的溢油事故中，在采用热水清洗等方法无法奏效情况下，用原位生物降解法对污染的160km海滩的有效治理，初步显示了生物修复技术的实用性[10]。目前，解决土壤石油污染的方法有物理修复、化学修复和生物修复。传统的物理、化学修复成本高，且处理不当会引起二次污染，或者仅仅使污染物从一个环境体系转移到另一个体系[11]。生物修复是指利用生物学方法将存在于环境中的有机污染物降解成CO2和H2O或其他无害物质的过程[12]。石油污染土壤的微生物修复技术以其高效、环保等优点备受学术界关注。2.2微生物降解石油烃的机理石油烃是链烷烃、环烷烃、芳香烃的复杂混合物。链烷烃的代谢机理是脱氢作用、羟化作用和过氧化作用[13]。通常正烷烃的生物降解是由氧化酶酶促进行的,首先烷烃氧化成相应的伯醇,然后经由醛转化成脂肪酸,脂肪酸通过β-氧化降解成乙酰辅酶A,后者或进入三羧酸循环,分解成CO2和H2O,并释放出能量,3或进入其他生化过程。链烷烃也可直接脱氢形成烯烃,烯烃再进一步氧化成醇、醛,最后形成脂肪酸;或氧化成为一种烷基过氧化氢,然后直接转化成脂肪酸。有的微生物还可以通过亚末端氧化形成仲醇,再依次氧化成酮、酯,酯水解形成伯醇和脂肪酸,再进一步氧化分解。一些微生物能将烯烃代谢为不饱和脂肪酸并产生某些双键的位移或产生甲基化,形成带支链的脂肪酸,再进行降解。环烷烃是石油烃中难于被微生物降解的烃类。环烷烃没有末端甲基,它的生物降解原理和链烷烃的亚末端氧化相似,经混合功能氧化酶氧化后产生环烷醇,然后脱氢形成酮,再进一步氧化得内酯,或直接开环生成脂肪酸。苯与短链烷基苯在脱氢酶及氧化还原酶的作用下,经二醇的中间过程代谢成邻苯二酚和取代基邻苯二酚。后者可在邻位或间位处断裂,形成羧酸。多环芳烃（PAHs）的降解首先通过微生物产生的加氧酶进行定位氧化反应。真菌产生单加氧酶,将氧原子加到苯环上,形成环氧化物,然后加入H2O产生反式二醇和酚;细菌产生双加氧酶,将两个氧原子加到苯环上,形成过氧化物,然后氧化成顺式二醇,脱氢产生酚。环的氧化是微生物降解多环芳烃的限速步骤。不同的代谢途径有不同的中间产物,但普遍的中间代谢产物是邻苯二酚、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸。这些代谢物通过相似的途径降解:环上的碳键断裂,经丁二酸、反丁烯二酸、丙酮酸,生成乙酸或乙醛。代谢产物一方面可被微生物用于合成细胞成分,一方面也可氧化成CO2和H2O[14]。2.3石油污染土壤微生物修复的特点微生物修复技术是微生物起主导作用的方法，即在人为强化的条件下用自然环境中的土著微生物或人为投加外源微生物对环境中的石油污染物进行转化、降解与去除[15－16]。微生物具有种类多、繁殖快、比表面积大、易变异等特点，因此微生物修复与传统物理、化学修复相比，具有诸多优点:(1)成本低;(2)修复效果优;(3)污染物的氧化反应完全，不引起二次污染;(4)不破坏土壤生态环境;(5)可进行原位修复处理，操作简单。石油污染土壤的微生物修复可以通过改变外界条件(包括温度、湿度、盐分、通气量、养分含量和添加表面活性剂等)，也可以通过生物强化修复，接种驯化获得的高效降解菌株(菌群)来提高土壤中石油的降解速率[17-18]。但是，该技术4对难降解化合物(如高分子芳香烃类化合物和石蜡、沥青等物质)的降解效果以及在采油区贫营养型土壤中的适用性等尚需深入研究。三、具有高效降解能力的微生物选择3．1土著微生物的筛选自然界中具有降解烃类化合物能力的微生物约占微生物总数的1%，由于石油污染物的存在，具有降解烃类化合物能力的微生物可增加到10%[19]。对降解石油烃类化合物起重要作用的细菌包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、微球杆菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Fla-vobacteria)、诺卡氏菌属(Nocardio)、不动杆菌属(Acinetobact-er)、气单胞菌属(Aeromonas)和产碱杆菌属(Alcaligenes)等，真菌包括木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)等。Sood等从印度Digboi冶炼厂油泥中分离获得1株可降解石油烃的假丝酵母菌，该菌株可以在pH值为3的强酸性条件下1周内降解石油烃达75%[20]。司美茹等从山东胜利油田附近石油污染土壤中分离获得1株石油降解菌，经鉴定该菌株为链霉属白孢类群，其药瓶培养的石油降解率为66.4%[21]。通常微生物对石油中特定成分和结构有较强的专一性，因此，石油污染土壤的微生物修复需要由多种石油烃降解菌协同完成。Richard等通过富集培养获得7株以柴油为碳源的石油烃降解菌，其中3株菌对芳香烃和脂肪烃类物质有降解作用，4株对石油烃类化合物无降解作用，但可以加速其余3株菌对石油的降解[22]。崔志松等以两种海洋专性解烃菌构建石油降解菌群,采用多种手段分析、比较降解菌纯培养和降解菌群对原油的降解率及石油降解后产物的多元色谱图。结果显示构建的降解菌群中2种专性解烃菌具有明显的协同效应[23]。3.2构建基因工程菌随着现代分子生物学的发展，通过现代生物工程技术定向改造微生物菌株可获得工程菌。工程菌具有高效、适应性强等优点，可以同时降解土壤中多种石油5烃类污染物。1999年，Ckibe等克隆了1株石油降解菌的醛脱氢酶(aldehydede-hydrogenase)基因，并在大肠杆菌中成功表达[24]。2003年，Co