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专题26基因工程高考生物(江苏专用)考点1基因工程的工具与操作程序1.(2014江苏单科,23,3分)下列关于基因工程技术的叙述,错误的是(多选) ()A.切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达五年高考A组自主命题·江苏卷题组答案ABC限制酶的识别序列多为6个核苷酸,也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,A错误;PCR反应中,起初的90~95℃高温是使目的基因解旋,后冷却至50℃左右是使引物结合到互补DNA链上,最后再加热至72℃左右是让DNA聚合酶催化DNA的子链延伸,B错误;载体质粒上的四环素抗性基因、青霉素抗性基因等抗生素抗性基因常作为标记基因,C错误;目的基因即使成功地插入到受体细胞染色体上,如果不是在启动子和终止子之间,也不能正常表达,D正确。错因分析错答集中在C选项上。主要原因可能是:①将“抗生素合成基因”误以为是“抗生素抗性基因”;②可能是学生对抗生素抗性基因在基因工程操作中的作用还了解不够。2.(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的α-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因(1656个碱基对),利用基因工程大量制备α-淀粉酶,实验流程见图。请回答下列问题: (1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前,需先获得细菌的。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是。(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中的设定与引物有关,的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)①变性温度②退火温度③延伸温度④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列:5'-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU……-3'图中虚线框内mRNA片段包含个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有种。(5)获得工程菌表达的α-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如下:缓冲液50mmol/LNa2HPO4-KH2PO450mmol/LTris-HCl50mmol/LGly-NaOHpH6.06.57.07.57.58.08.59.09.09.510.010.5酶相对活性%25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根据上述实验结果,初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为。答案(8分)(1)基因组DNA(2)5'使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连(3)②⑥(4)813(5)pH为8.5,缓冲液为50mmol/LTirs-HCl解析(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有α-淀粉酶基因,因此在扩增α-淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。(2)由于引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,是与引物的3'端相连的,由此确定需在引物的5'端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体,防止自身相连。(3)进行PCR扩增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA上5'端为AUG(起始密码子),因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基,可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子已经固定为U,因此还有2个碱基未知,共可能有的种数为4×4=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数据可知:α-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50mmol/LTris-HCl的条件下相对活性为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。3.(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过获得用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的位点。设计引物时需要避免引物之间形成,而造成引物自连。(3)图中步骤1代表,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有(填序号:①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物)。答案(8分)(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高(5)②③解析本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。知识归纳关于引物的几个问题:①引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为20~30个核苷酸。②由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。③结合DNA结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。4.(2016江苏单科,33,9分)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题:限制酶BamHⅠBclⅠSau3AⅠHindⅢ识别序列及切割位点 ATCCCCTA ATCAACTA GATCCTAG GCTTTTCG GGGGTGGT AAAA图1图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒,需将其转入处于态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加,平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中。(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列为,对于该部位,这两种酶(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得种大小不同的DNA片段。答案(9分)(1)BclⅠ和HindⅢ连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)TGATCCACTAGG 都不能(4)7GGATCACCTAGT解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)分析4种限制酶识别的序列可知:BamHⅠ和BclⅠ识别序列中含有Sau3AⅠ的识别序列,这三种酶切割DNA后可以产生相同的黏性末端。为保证质粒上含有标记基因,切割质粒时不能选用BamHⅠ和Sau3AⅠ,应选用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割;酶切后的载体和目的基因片段,需用DNA连接酶连接形成重组质粒,为了扩增重组质粒,需将其转入处于感受态的大肠杆菌中。(2)重组质粒中四环素抗性基因结构完整,氨苄青霉素抗性基因结构被破坏,在筛选平板培养基中添加四环素可以筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌。PCR扩增目的基因时,需用引物甲和引物丙两种引物。(3)BamHⅠ酶切产生的黏性末端为 ,BclⅠ酶切产生的黏性末端为 ,经DNA连接酶连接后,连接部位的6个碱基对序列为 ,此序列不能被BamHⅠ和BclⅠ识别,因此不能被两种酶切开。(4)图1质粒中含有Sau3AⅠ酶的3个识别序列,如图:(A、B、C分别表示相邻切点间的DNA片段)用Sau3AⅠ酶切,若在一个切点处切割可得到:B+C+A、C+A+B、A+B+C三种DNA片段(但其大小相同),若在两个切点处切割可得到:A、B+C、A+C、B、A+B、C六种DNA片段(其大小均不同);若在三个切点处均切割,可得到A、B、C三种大小不同的DNA片段,综上所述,用Sau3AⅠ酶切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。疑难突破准确识别出BamHⅠ酶和BclⅠ酶识别序列中含有Sau3AⅠ酶的识别序列,是准确解答本题的关键。注意第(4)小题,Sau3AⅠ酶可能打开1个切点、2个切点和3个切点三种情况。5.(2015江苏单科,32,9分)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体,图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题:图1 图2(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是。(2)图1中启动子是酶识别和结合的部位,有了它才能启动目的基因的表达;氨苄青霉素抗性基因的作用是。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有。(4)β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链,且β-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为。(6)根据图2中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是,理由是。答案(9分)(1)终止子(2)RNA聚合作为标记基因,将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来(3)限制酶和DNA连接酶(4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解(5)β-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸,而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸(6)至少2个两条肽链的一端各有一个游离的氨基,氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基解析(1)完整的基因表达载体应包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等,图1中没有标注出终止子。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动转录出mRNA;氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,可利用含氨苄青霉素的培养基筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体需用限制酶分别切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶将两者连接形成重组质粒。(4)利用β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达的意义是将胰岛素肽链上的蛋白酶切割位点隐藏在β-半乳糖苷酶内部,从而防止胰岛素A链或B链被大肠杆菌体内的蛋白酶降解。(5)根据溴化氰的作用特点可知,溴化氰可将β-半乳糖苷酶切成多个肽段,但不会切割胰岛素A、B链,这与肽链中含有的甲硫氨酸数量有关。(6)由于每条肽链的一端都含有一个游离的氨基,所以蛋白质分子中游离氨基的数量=肽链数+R基上游离氨基数,故可推测胰岛素(由A、B链组成)至少含有2个游离的氨基。易错警示①基因表达载体几个组成部分中,启动子和终止子是常考查的内容,也是易与mR-NA上起始密码子和终止密码子相混淆的知识。②避免将“游离氨基”与“氨基残基”混淆。考点2基因工程的应用与蛋白质工程B组统一命题·省（区、市）卷题组考点1基因工程的工具与操作程序1.(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两