质粒的提取与转化

2014年11月27日质粒的提取与转化目的背景知识目录质粒转化大肠杆菌质粒的提取目的•了解质粒的概念及相关知识。•了解质粒DNA转化的原理和方法。•掌握质粒DNA转化大肠杆菌的操作步骤。•掌握碱裂解法和利用试剂盒提取质粒的方法。目的背景知识目录质粒转化大肠杆菌质粒的提取质粒载体是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点质粒背景知识背景知识•质粒（plasmid）通常以共价（covalent）、闭合(closed)、环状(circular)的超螺旋双链DNA（CovalentlyClosedCircularDNA,cccDNA）分子存在于细胞中。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。背景知识◆如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA,简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(LinearDNA)。背景知识◆质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环状的超螺旋双链DNA（cccDNA,SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。质粒的命名第1个字母(小写)：p，质粒（plasmid）;第2，3个字母(大写)：人名，实验室名，表型性状或其他特征的英文缩写;编号(阿拉伯数字)：区别同一类型的不同质粒例：pUC18,pUC19质粒图谱GoMCS(multiplecloningsite)复制原点筛选标记目的DNA片段质粒TA载体连接重组质粒目的DNA转化无质粒的E.Coli死亡有质粒的E.Coli存活含抗生素培养基中生长重组质粒的鉴定PCR平板筛选目的背景知识目录质粒转化大肠杆菌质粒的提取质粒转化大肠杆菌•转化（Transformation）：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。常用的转化方法有热击法和电转化法。转化原理•热击法：大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。转化原理•电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。转化前准备工作A.制备选择性培养基平板(eg：Amp和Kana)（若放置在冰箱内应提前取出）；B.预热42℃水浴，预热未添加抗生素的LB液体培养基；C.预热37℃恒温摇床；D.提前给超净工作台照射紫外消毒；转化步骤1，从-70℃取出感受态细胞，放在冰上融化；2，每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA（体积不超过5μl），用枪头轻轻混匀（也可转动Ep管混匀），在冰上放置30分钟；3，热击：将离心管放置42℃水浴，热击60~90秒。4，冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置2分钟；5，复苏：每管加700μlLB培养基（预热），在37℃摇床温育45分钟（~90rpm），使细菌复苏；（超净工作台内操作）转化步骤6，布皿：取适当体积（根据实验需要）均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LB平板；（超净工作台内操作）7，培养：倒置培养皿，于37℃培养12~16小时即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）X-gal+IPTG+AMPwithlacZ=bluecolony目的背景知识目录质粒转化大肠杆菌质粒的提取1)培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；3)分离纯化质粒DNA。质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：√去除蛋白质√去除基因组DNA√去除RNA*酚-氯仿抽提法*RNase消化？？？质粒的提取原理大肠杆菌遗传物质1、部位不同：2、大小不同：质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5106bp。基因组DNA容易断裂线性化质粒DNA与基因组DNA的区别碱裂解法提取质粒的原理原理：1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA。碱裂解法提取质粒试剂1)细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTAPH8.02)细菌裂解液（溶液II）--裂解菌体0.2mol/LNaOH1%SDS碱裂解法提取质粒试剂3）中和液（溶液III）----中和NaOH60ml5mol/L醋酸钾11.5ml冰醋酸28.5ml水4）20mg/mlRNase----降解细菌RNA工作浓度30～50g/ml其他试剂作用和成分同实验一。碱裂解法提取质粒操作步骤碱裂解法提取质粒操作步骤（1）细菌的收获：取1.5ml新鲜菌液8,000转/分，离心5min，弃上清。（2）细菌的裂解：加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌。加入200l细菌裂解液（溶液II），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。注：粘稠，开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。（3）中和：加入150l中和液（溶液III），上下颠倒混合后置冰上5min，12,000转/分，4℃离心10min。碱裂解法提取质粒操作步骤（4）去除蛋白质:将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000rpm离心5min。（5）去除酚:将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min，12,000rpm离心5min。分离沉淀水相有机相中间界面乙醇沉淀质粒DNA碱裂解法提取质粒操作步骤（6）沉淀DNA:将上层水相移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀10~15min。（7）12,000rpm,4℃离心5min。弃上清，室温干燥质粒DNA5~10min。（8）去除RNA:用20l含RNase的水溶解质粒DNA，轻轻吹打混合。37℃保温10min。碱裂解法质粒原理质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳取5l的质粒DNA加1l上样液混匀。加到~1%琼脂糖凝胶的加样孔内。电泳条件：100V30~40min。电泳结束后照像保存，结果分析。质粒的电泳质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环开环超螺旋线性质粒DNA的存在形式有3种:1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.试剂盒提取质粒1)培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；3)分离纯化质粒DNA。质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：质粒的提取原理试剂盒提取质粒步骤1.取1.5~4.5ml过夜培养的菌液，9000rpm离心5分钟，弃上清，收集菌体，尽可能的倒干上清。2.用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。3.加250μl溶液P2，温和地上下翻转6~10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。用时不超过5分钟。4.加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转6~10次，室温放置5分钟。室温13,000rpm离心10分钟，小心取上清。试剂盒提取质粒步骤5.将吸附柱安置于收集管上，将上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中，溶液太多可分两次加入），13,000rpm离心1分钟，弃滤液。6.加入500μl去蛋白液PE，13,000rpm离心1分钟，弃滤液。7.加入500μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！）13,000rpm离心1分钟，弃滤液。试剂盒提取质粒步骤8.重复步骤7一次，13,000rpm离心1分钟，弃滤液。空柱13,000rpm离心2分钟。室温放置3~5分钟，出去残留乙醇。9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附柱的中间部位加60~100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中预热效果更好），室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。试剂盒提取质粒1.菌体老化2.碱裂解不充分3.菌体中无质粒4.溶液使用不当1.请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养2.可减少菌体用量或增加溶液的用量3.不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。4.溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？原因对策质粒DNA提取常见问题1.混有蛋白2.混有RNA3.混有基因组DNA1.不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.加入RNaseA室温放置一段时间3.加入溶液II和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。问题二：质粒纯度不高，如何解决？原因对策质粒DNA提取常见问题谢谢！