搜索
基因工程制取第一代干扰素制药一班第一小组将目的基因克隆到大肠杆菌中的重要操作步骤：目的基因的分离克隆载体目的基因与克隆载体的体外重组重组体导入大肠杆菌K12受体菌的培养及筛选→→→从受体菌中获取目的基因表达载体重组质粒导入大肠杆菌受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测→工程菌一、目的基因的分离2.mRNA的分离（注意事项）将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取相对分子质量为256bp的部分1、总RNA的提取RNA提取方法：Trizol法1.目的基因的获取为什么用mRNA而不是DNA？mRNA的分离：3、mRNA反转录成cDNAcDNA第一链的合成（ReverseTranscription）。选用GIBICOL公司提供的SuperScriptTMPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesis试剂盒使用Oligo(dT)引物（因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。）（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg，补充适量的DEPCH2O使总体积达11μl。在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，轻轻混匀、离心。（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10×PCRbuffer2μl25mmMgCl22μl10mMdNTPmix1μl0.1MDTT2μl轻轻混匀，离心。42℃温育2-5min。（3）加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中温育50min。（4）于70℃加热15min以终止反应。（5）将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃温育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。4、PCR扩增目的基因PCR扩增的操作条件•双链cDNA在94℃预变性5min，94℃变性30s，迅速冷却到50℃，引物退火并结合到靶序列上复性2min，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸5、从PCR中分离目的基因•PCR扩增产物电泳•将PCR扩增产物适当浓缩（开盖）后，全部上样与2.5%的琼脂糖（TEA）缓冲液，电压60V，电泳时间2h。通过凝胶成像系统观察分析谱带的形状，切取512pb处的目标片段，双蒸水洗涤三次，离心得目的基因。•测序：Sanger双脱氧链终止法1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。同聚物加尾法6、人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补二、目的基因与克隆载体进行体外重组（2）具有两种抗菌素抗性基因(四环素、氨苄青霉素抗性基因)可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,便于分子克隆的筛选。（3）含有高效的自主复制成分，质粒的复制和宿主的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNA停止复制，但质粒可以继续利用细菌原有的酶系统进行复制。（4）限制性内切酶单一切口，在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。（1）具有较小的分子量，避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂,pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段1、选择质粒pBR322作为载体的原因：图为：质粒pBR3222、基因与克隆载体的连接将cDNA重组到载体上合成的cDNA与载体DNA进行连接一般有3种方法：①借助于末端转移酶的3'-OH端合成均聚物的能力，双链cDNA和线性化载体DNA的3'-OH端分别加上均聚核苷酸链；②双链cDNA和线性化载体DNA分别用Klenow片段进行末端补平，然后用T4DNA连接酶进行齐头连接，形成重组体；③通过粘性末端连接。√EcoRIBamHIEcoRIBamHI（1）对质粒进行双酶切•为验证双酶切是否成功,可做如下对照:A酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.大肠杆菌k12几百ng-几ugEcoRI0.5ulBamHI0.5ulbuffer在Takara产品目录查双酶切buffer表，按照那个倍数加，有时候需要BSA水补足20ul酶切3个小时（2）质粒与目的基因的连接1、取2μl（50-400ng）载体和7倍摩尔量的插入片段混合好以后置于45度水浴5min马上置于冰上冷却（插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。）。2、加入2μl10×LigationBuffer（连接缓冲液，内含ATP），用双蒸水调整总体积为20ul，混匀。然后加入T4连接酶1ul，轻柔充分混匀（切勿剧烈震荡，可能导致酶部分失活）。16℃连接2小时三．重组体引入宿主细胞将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因（检验1.外源基因基因是否进入宿主细胞2.载体DNA分子中是否插入了外源DNA片段）的质粒pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这样的转化子群体构成该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。选择大肠杆菌作为宿主细胞的原因？•1、培养基的配制•（1）.配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基：精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠l0g，加去离子水800ml充分搅拌溶解，用1mol/LNaOH调pH7.0，补加去离子水至1000毫升，高压灭菌，4度保存。•（2）.LB固体培养基：LB液体培养基中加1.5%琼脂粉,高压灭菌消毒；•（3）.Amp母液：用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml即100ug/ul溶液,置-20℃保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得。然后分5支分装(浓度100mg/ml即100ug/ul)。（4）.含Amp的LB固体培养基：将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板（30ml/90mm）：即多少毫升培养基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减半量则最终浓度为50ug/ml。有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基。•（5）.0.05mol/LCaCl2溶液:其实氯化钙的摩尔浓度在0.05-0.1mol/L均可。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。（6）.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:先配制成0.1mol/L的氯化钙溶液50ml，加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。2、感受态细胞（大肠杆菌k12）的制备(CaCl2法，亦可直接购买)--注意事项（1）、将培养液分转入1.5ml的离心管中（一管10ml菌液可分装成约6管1.5ml的离心管中）,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。（2）、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液200微升轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。（3）、弃去上清,加入200微升预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。3、转化-注意事项：a、全量（20μl）加入至100μl感受态细胞中，冰中放置30分钟。b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。c、加入890μlAMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。取100μl铺板（注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来，另，铺板前后注意用吹风机吹干）。四、从大肠杆菌k12获取目的基因•1、大肠杆菌K12培养•2、扩增杂交质粒•3、利用质粒PBR322特性通过四环素和氨苄青霉素筛选阳性菌•4、提取重组质粒5、利用DNA探针获取目的基因•6、目的基因与表达载体PBV220结合构成重组质粒•7、重组质粒导入大肠杆菌•8、工程菌的筛选，质粒稳定性检测•大肠杆菌K12的培养培养基：LB液体培养基酵母膏5g,蛋白胨10g,NaCl10g,加蒸馏水至1000mL,pH7.0,经121灭菌20min备用,生理盐水:0.9gNaCl溶于100mL蒸馏水,经121°灭菌20min备用。•接种培养：用接种环刮取少量细菌于1mL生理盐水中,震荡均匀,吸0.1mL于100mLLB液体培养基中,在37°,180r.min-1摇床振荡培养。阳性细菌筛选原因：由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况•流程：步骤一：将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养，就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落。•步骤二：步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因：因为PBR322含有抗四环素基因，重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。提取重组质粒•1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培养基中扩大培养15h。培养时间：前人实验证实大肠杆菌K12生长前6h为迟缓期,6~15.5h为对数增时期,15.5~19.5h为稳定期,19.5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制。•2、细菌的收获和裂解１）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。•3、碱裂解法１）将冼过的500ml培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤3]重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中。溶液Ｉ:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，在10lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于４℃。２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/LTris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1％SDS盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。•４）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。５）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤４）]。６）上清过滤至一2