实时定量PCR-

实时定量PCR（qRT-PCR）实时定量PCR（qRT-PCR）PolymeraseChainReaction（PCR）聚合酶链式反应伟大的天才发现！KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链PCR的基本原理PCR的基本原理模板DNA94℃50-65℃引物1引物2DNA引物72℃PCR的基本原理引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束94℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50-65℃TaqTaqTaqTaq72℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束PCR基本原理Mg2+模板引物dNTPDNA聚合酶PCRPCR反应基本要素1、单、双链DNA，cDNA均可2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂DNA结合蛋白类3、一般100ngDNA模板/100L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加（1）模板1、引物浓度一般为0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降2、引物的设计（2）引物（3）TaqDNA聚合酶1、酶的用量一般为0.5-2.5U/50l，2、酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）Mg2+1、Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，一般用量为0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。2、Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。3、Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度2、四种dNTP浓度应相等3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）dNTP(1)变性使双链DNA解链为单链,94℃30-40s(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。循环参数（3）延伸68-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次次数过多,扩增效率降低,错误掺入率增加常用PCR反应体系(以HiFiTaq为例)模板1.0μL上游引物0.5μL下游引物0.5μL10XHiFiBuffer（+Mg2+）2.5μLdNTPs2.0μLHiFiTaq酶0.2-0.3μLddH2O补足25μL共25μL常用PCR反应条件94℃2-5min94℃30-40sTm30-45s72℃1min/1kb72℃10min12℃+∞25-35个循环几种常用PCR技术RT-PCR(ReverseTranscriptionPCR)反向PCR(ReversePCR)RACE(Rapid-AmplificationofcDNAEnds)qRT-PCR(QuantitativeRealTimePCR)基因mRNA蛋白质多肽链RT-PCR(反转录PCR)DNA水平RNA水平蛋白水平RT-PCR基本原理mRNAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTReverseTranscriptionmRNAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTcDNART-PCR一般步骤1、RNA提取RNA质量的检测一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的完整性和纯度完整性检测（1%琼脂糖胶电泳）纯度检测（OD260/280）OD260/280一般介于1.9-2.1之间，小于1.9时蛋白污染；大于2.1时RNA发生降解28S18S5S2、反转录RT-PCR一般步骤在冰盒上加入以下试剂：组成体积随机引物或OligodT）1μL1-5μgTotalRNAxμLDEPC-TreatedH2OyμL体系配制完成后瞬时离心，70℃反应5min,然后迅速转移至冰盒，冰浴2-5min,此步骤的作用是去除mRNA的二级结构。RT-PCR一般步骤组成体积5XBuffer4μLdNTPs1μLRNAseinhibitor1μLM-MLV1μLDEPC-TreatedH2OxμL1、混匀，42℃，90min2、70℃，10min，终止反应3、A3检测在冰盒上加入以下试剂：反向PCR(reverse）PCR)已知序列未知序列未知序列反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR原理cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplificationofcDNAEnds,RACE)是一种基于PCR技术从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。RACE(rapid-amplificationofcDNAends)AAAAAAAAmRNA接头序列AAAAAAAAmRNAGeneRacer3'PrimerGSP2GeneRacer3'NestedPrimerNGSP2ReversetranscriptionGeneRacerOligodTPrimerTTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCGcDNATTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG已知片段RACE3'RACE原理mRNAAAAAAAmRNANNNNNNNNNNNAAAAAAOligodTReverseTranscriptionNGSP1GeneRacer5'NestedPrimerGSP1GeneRacer5'PrimerGeneRacerRNAOligoSequenceNNNNNNNNNNN接头序列TTTTTTNNNNNNNNNNNcDNAmRNAAAAAAANNNNNNNNNNN已知片段5'RACE原理qRT-PCR(QuantitativeRealTimePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针Amplifluor(Intergen)1、SYBRGreen法SYBRGreen工作原理SYBRGreen法优缺点融解曲线（dissociationcurve）正常有非特异性扩增2、TaqMan探针法作用机理TaqManTaqMan法与SYBRGreenI的比较几个重要概念基线（Baseline）荧光阈值（threshold）荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。Ct值（thresholdvalue）每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为Ct值。研究表明，各模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。定量PCR的数学原理荧光定量PCR的解析方法相对定量内参基因目的基因120.2内参基因内参基因：qRT-PCR时，每个标本都要做对应的内参，而且每次都是管家基因，一般用β-actin，有时也用GAPDH。管家基因：又称持家基因(house-keepinggenes)生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。内参基因的选择理想的内参基因应该满足以下条件：1、不存在假基因，以避免基因DNA的扩增2、高度或中度表达，排除低表达3、稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别4、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关5、其稳定的表达水平与目标基因相似6、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响常用内参基因家蚕常用内参基因Actin3GAPDHsw22934数据处理（ΔΔCt法）qRT-PCR的优点及限制因素qRT-PCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染的问题、自动化程度高等特点qRT-PCR限制因数实验费用昂贵，需要设置多组重复和对照怎样避免扩增基因组DNA、如何消除和评定由于样品处理、仪器的差异和个人操作而带来的误差以及如何更准确定量基因？值得指出的是，qRT-PCR只能定量mRNA水平，但mRNA水平可能不能反映细胞中蛋白水平，因为在转录后还有诸多调节因素。要准确而全面的了解机体的表达水平，除了分析mRNA水平外，还需要免疫组织化学和生物化学实验的数据。更多关于qRT-PCR的信息，请参照：引物设计常用引物设计软件：primerPremier，Oligo序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列引物长度：17-25bp碱基尽可能随机分布,GC%：40%-60%尽量避免错配（FalsePriming)、引物二聚体(Dimer)和发夹结构（Hairpin）引物设计引物长度：17-25bpGC%:40-60%Tm:60℃（PrimerPremier5.0）产物长度：80-300bp,100-200bp最佳