荧光定量PCR原理及应用(科研版)

东胜创新生物科技有限公司实时荧光定量PCR技术简介应用工程师张晓辉东胜创新•实时荧光定量PCR原理•荧光定量PCR仪简介•实时荧光定量PCR在科研上的应用•实时荧光定量PCR实验设计实例东胜创新的原理：•什么是实时荧光定量PCR•荧光化学•双通道与内标•基因分型（SNP）检测东胜创新技术：PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析S1S2M常规PCR东胜创新结合电泳分析方法的缺点•只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量•必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析,费时费事•无法对扩增反应实时检测•EB有毒东胜创新技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析定量PCR东胜创新原理•实时荧光定量PCR三个关键词：•实时，荧光，定量•如何实时检测？？？•借助荧光物质示踪扩增产物量的变化定量PCR东胜创新原理•在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质，随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化荧光曲线东胜创新•如何对起始模板定量？•通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析•引入两个概念：•荧光阈值、Ct值实时荧光定量PCR原理定量原理东胜创新荧光阈值•在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)ThresholdlineC(t)value实时荧光定量PCR原理定量原理东胜创新值的概念•Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)value东胜创新Log浓度与循环数呈线性关系初始模板量越多,扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少确定初始模板的浓度实时荧光定量PCR原理定量原理东胜创新原理定量原理•理想的PCR反应：•X=X0*2n•非理想的PCR反应：•X=X0(1+Ex)n•n：扩增反应的循环次数•X：第n次循环后的产物量•X0：初始模板量•Ex：扩增效率东胜创新原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量东胜创新定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。如何定量荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线.未知10410310610510210实时荧光定量PCR原理东胜创新•DetermineC(t)valueforunknown•Interpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies实时荧光定量PCR原理东胜创新原理阈值的选择•荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍东胜创新原理•为什么要用Ct值定量•实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。东胜创新原理•相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性Ct值的重现性东胜创新的比较•Absolutequantificationispossible•Sensitive–Detectslowercopiesoftarget–Detectssmallfolddifferences•Sampleswithabroadrangeofconcentrationsareanalyzedwithoutnormalizingconcentration•Costeffectiveandtimeefficient•Flexibleassaydesign东胜创新的原理：•什么是实时荧光定量PCR•荧光化学•双通道与内标•基因分型（SNP）检测东胜创新原理•示踪扩增产物量变化的荧光物质及其工作原理东胜创新SYBRGreen1MolecularBeaconsTaqMan荧光化学MJR系列实时荧光定量PCR仪之东胜创新仪之SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA东胜创新•SYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNA•Post-amplificationmeltingcurveanalysisMJR系列实时荧光定量PCR仪之SYBRGreenI工作原理东胜创新优点使用方便---不必设计复杂的荧光探针没有序列特异性---可以用于不同的模板便宜灵敏MJR系列实时荧光定量PCR仪之东胜创新缺点与非特异性产物结合MJR系列实时荧光定量PCR仪之东胜创新•Graphfluorescenceintensityvs.temperature•Decreasingfluorescencerecorded–Duetoincreasingtemperature–DuetodenaturationandreleaseofSGI•TmisthepointofinflectiononthemeltingcurveTemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmMJR系列实时荧光定量PCR仪之SYBRGreenI融解曲线分析东胜创新•Plotthenegativeoftherateofchangeoffluorescencevs.temperature(-dI/dT)-dIdTTmMJR系列实时荧光定量PCR仪之SYBRGreenI融解曲线分析东胜创新融解曲线分析•Identicalreactioncomponents,exceptinitialtemplateconcentrationvaries10,000copiesNon-specificproductAmpliconAmplicon10copies东胜创新系列实时荧光定量PCR仪之SYBRGreenI融解曲线分析东胜创新系列实时荧光定量PCR仪之SYBRGreenI融解曲线分析东胜创新•Forreliablenucleicacidquantification,eachprimersetrequiresindividualoptimization•Parametersusedtooptimizereactionspecificityandefficiency–Primerdesign–Amplicondesign–Concentrationofreagents–Cyclingconditions•DenaturationandannealingtemperaturesMJR系列实时荧光定量PCR仪之Real-timePCR体系优化东胜创新•Dynamicthermalgradientallowsforone-stepreaction-temperatureoptimization•Upto24oCgradientrangeMJR系列实时荧光定量PCR仪之Real-timePCR体系优化东胜创新