HPLC原理与应用

高效液相色谱法化学化工学院1.HPLC仪器结构及原理注射器进样器高压泵混合室溶剂预柱接头色谱柱检测器数据系统根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异，因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而实现分离的目的1.HPLC仪器结构及原理3.操作条件的选择—流动相的选择流动相要求：(1)溶剂应当是高纯度，溶剂与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性；(2)溶剂的性能与使用的检测器应当匹配；选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长，甲醇：205nm;乙腈：190nm(3)溶剂对样品应有足够的溶解能力；(4)溶剂应具有低的粘度和适当低的沸点；(5)尽量避免使用具有显著毒性的溶剂。常用流动相溶剂：反向色谱常用流动相及冲洗强度H2O甲醇乙腈丙醇异丙醇四氢呋喃最常用组成：甲醇/H2O、乙腈/H2O洗脱顺序：极性物质先洗脱下来正想色谱常用流动相及冲洗强度正乙烷乙醚乙酸乙酯异丙醇洗脱方式—等度洗脱、梯度洗脱等度洗脱：整个洗脱过程中，流动相的组成比保持不变梯度洗脱：在一个分析周期中，按照一定的时间程序连续或阶段性的改变流动相的组成比，从而改变溶剂的极性、离子强度、pH值等，使每个组分在适宜的条件下获得分离。梯度洗脱优点：改善峰型；提高柱效；减少分析时间；使强滞留组分不容易残留在柱子。梯度洗脱装置二元高压梯度：先加压后混合利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例输入梯度混合室，混合后进入色谱柱。一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或者多种不同极性的溶剂按一定比例抽入高压泵中混合四元低压梯度：先混合后加压4.HPLC在各领域的主要应用1.环境:多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、酚类化合物、邻苯二甲酸脂等。2.食品:食品营养成分分析、食品添加剂分析、食品污染物分析。3.医药:合成药物：抗生素、抗忧郁药物、黄胺类药等；天然药物：鉴别中药真伪或者产地、吲哚碱、鸦片碱、强心甙测定等。4.农药:有机农药、除草剂等。5.化工:无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆品、染料等。1.环境保护——多环芳烃标准品色谱图萘苊烯苊芴菲蒽荧蒽芘苯并a蒽屈苯并b荧蒽苯并k荧蒽苯并a芘二苯并a，h蒽苯并g，h，i苝茚苯1，2，3-cd苝-1000100200300400500600700800900mV3691215182124273033min1.环境保护——苯及其衍生的分离谱图2.食品分析中的应用—食品营养成分分析啤酒中的有机酸分析2.食品分析中的应用—食品营养成分分析2.食品分析中的应用—食品添加剂分析三聚氰胺三聚氰酸猪肉中三聚氰胺和三聚氰酸的分析3.医药中的应用—抗生素的测定依诺沙星环丙沙星诺氟沙星3.医药中的应用—复方丹参片中丹参酮ⅡA的测定丹参酮ⅡA3.医药中的应用—中药白鲜皮的指纹图谱不同地区的白鲜皮指纹图谱考察A吉林仁和B黑龙江C哈尔滨D上海E长沙F承德围场G西安H乌鲁木齐4.化工中的应用—24种禁用偶氮染料色谱图1231098765423242221201918171615141311124.HPLC发展前景固定相的发展前处理方法检测器的发展联用技术的发明与应用4.HPLC发展前景—固定相的发展固定相基质高纯硅胶微球聚合物微球有机-无机复合物氧化钴微球多孔石墨微球键合及改性技术立体保护键合固定相包埋极性基团烷基键合固定相全氟烷基键合聚合物涂覆改性高纯硅胶基质固定相硅胶除了具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专一的表面化学反应等优点,还有一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基,这是硅胶可以进行表面化学键合或改性的基础。突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。化学键合的种类按键合官能团的极性分：极性和非极性键合。极性键合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。非极性键合相：各种烷基(C1～C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。硅胶键合固定相的应用10种混合物在大黄酸键合硅胶固定相(a)和C18(b)的色谱图聚合物基质固定相优点：色谱选择性好样品容量较大化学稳定性好不易产生非特异性吸附不足：刚性不理想、孔结构复杂、溶胀或收缩多孔石墨化碳固定相特点：稳定性好-在低或高pH条件下抑制酸碱离子极性样品具有较强的保留异构体选择性提高可分离旋光异构体可进行族分离流动相组成简单氧化钴基质固定相优点：稳定性好强碱分析速度快高温快速分析优点：高比例水流动相，不会导致烷基链收缩极性化合物(包括酸和碱性化合物)保留增强传统C18／C8固定相选择性不同可用低浓度缓冲溶液作流动相，以及固定相官能团低流失，适合于LC/MS包埋极性基团烷基键合固定相包埋极性基团键合相作用机理溶质与极性基团的作用；溶质和硅羟基与极性基团的竞争作用；极性基团增加表面层水浓度氟烷基键合固定相特点：在与C18/C8相似的流动相条件下，选择性改善卤代化合物和芳香异构体的保留更强分离含羟基、羧基、硝基和其它极性基团化合物具有显著优势4.HPLC发展前景—样品前处理方法固相萃取固相萃取优点：同步实现富集和纯化应用范围：水中有机污染物的痕量富集、水中半挥发性有机物的测定及大气和土壤样品的前处理4.HPLC发展前景—样品前处理方法分散液液微萃取分散液液微萃取特点：有机溶剂用量少，富集倍数高应用范围：适用于水溶液中有机物的提取，如有机磷农药、酚类物质等。也可用于水溶液中重金属(钯钴铅钒有机锡等)的萃取。4.HPLC发展前景—样品前处理方法固相微萃取：在固相萃取基础上发展起来，采用一根聚合物涂层的熔融石英纤维，从样品基质中或样品上方的顶空气体中直接吸附萃取待测物，然后再色谱进样口解吸、分析。优点：所需样本量少,避免了乳化现象,回收率高，重现性好,而且便于自动化操作。4.HPLC发展前景—样品前处理方法超临界流体萃取：利用超临界流体的溶解能力与超临界流体具有与流体相近的密度和与气体相近的豁度，扩散系数为液体的10倍至100倍，对很多物质有较好的渗透性和较强的溶解能力。优点：提取过程快速、简便，消除有机溶剂对人体和环境的危害，并可与许多分析仪器联用。4.HPLC发展前景—样品前处理方法微波辅助萃取：在微波中，由于吸收微波能力的差异使基体物质的某些区域或萃取习题的某些组分被选择性的加热，从而使样品中要分析的组分从样品基质中渗出，实现与基质的分离。优点：受溶剂亲和力影响小，设备简单，适用范围广，重现性好，节省时间和溶剂。4.HPLC发展前景—样品前处理方法浊点萃取：以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，通过改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分开。优点：萃取率高、富集因子大、操作简便、安全、经济，便于实现联用。4.HPLC发展前景—检测器种类：紫外检测器(UV)荧光检测器(FD)电化学检测器(ECD)蒸发光散射检测器(ELSD)示差折光检测器(RID)紫外检测器(UV)原理：基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。优点:a:灵敏度高，检测下限约为10-6g／mlb:线性范围广C:对温度和流速不敏感，适于进行梯度洗脱紫外检测器的类型:①固定波长型(已淘汰)；②可变波长型(最常用)；③二极管阵列检测器(最新型)。二极管阵列检测器（DAD）•时间、光强度和波长的三维谱图荧光检测器（FLD）原理:物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光波长较长的光，这种光称为荧光。荧光强度(F)与激发光强度(I0)及荧光物质浓度(C)成正比。优点：灵敏度高、选择性好，是微量组分和体内药物分析常用的检测器之一。荧光检测器（FLD）结构示意图HPLC-FLD检测发霉的花生中的黄曲霉素B1和黄曲霉素B2黄曲霉素B2黄曲霉素B1流动相：H2O:乙腈：甲醇(60/20/20,v/v/v)流速：1mL/min柱温：25℃电化学检测器(ECD)原理（电导检测器）：两个对电极测量样品中离子型溶质的电导，由电导的变化测定的浓度。原理（安培检测器）：利用待测物流入反应池时在工作电极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流通过，电流大小与待测物质浓度成正比。适用范围：凡具氧化还原活性的物质都能进行检测，本身没有氧化还原活性的物质经过衍生化后也能进行检测。优点：灵敏度很高，尤其适用于痕量组分分析。HPLC-ECD检测绿原酸、咖啡酸、阿魏酸蒸发光散射检测器(ELSD)原理：将洗脱液引入雾化器与气体混合形成均匀的微小液滴，蒸发除去流动相而样品组分形成气溶胶，进入检测室，用强光或激光照射气溶胶产生光散射，用光电二极管检测散射光。散射光的强度(I)与组分的质量(m)通常具有下述关系：I＝Kmb,散射光的对数响应值与组分质量的对数呈线性关系。HPLC-ELSD测定磷酸阴离子钙阳离子4.HPLC发展前景—联用技术的发明与应用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）液质(LC/MS)联用系统的示意图HPLC-MS优点：1.是一种软电离方式，适合稳定性差、极性大、分子量大的物质的电离。2.主要生成准分子离子（[M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+等），生物大分析产生多电荷离子。3.灵敏度高4.不能进行谱库检索5.不适用于非极性化合物的分析HPLC-MS应用LC/MS检测:利血平高效液相色谱-串联质谱技术（HPLC-MS/MS）HPLC-MS/MS:第一级质谱分离感兴趣的离子，第二级质谱通过在碰撞过程中产生的碎片谱来表示其特征。与HPLC-MS比较：HPLC-MS/MS技术可减少或消除样品基质中无关物的干扰，特异性好，灵敏度高，分析速度快，提供丰富的结构信息，为物证鉴定提供绝对可靠的依据，如毒物分析、滥用药物鉴定、爆炸残留物分析等.高效液相色谱-共振瑞利散射联用技术（HPLC-RRS）联用装置图HPLC-RRS优点分离效率高分析数度快选择性好自动化检测为无电化学性质和光谱性质的物质提供新的检测手段可直接用于复杂样品中微量组分的分离及测定。HPLC-RRS的应用HPLC-RRS技术和HPLC-UV检测土霉素、四环素、金霉素、强力霉素图谱HPLC-RRS测定血样中氨基糖苷类抗生素4.HPLC发展前景—联用技术的发明与应用高效液相色谱-核磁共振波谱联用（HPLC-NRM）优点：1.分离和结构解析2.对光、氧不敏感缺点：1.灵敏度低2.线宽与流速有关3.多溶剂信号突出4.耗时HPLC-NMR的应用问题？