第四章-病毒抗原与抗体检测技术讲述

预防医学实验中心柏桦一、抗原—抗体反应特异性高可逆氢键、范德华力、静电吸引力可见抗原-抗体比例适宜，复合物相成团二、影响反应的因素电解质pH≥7时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀温度37℃温度升高，反应加快56℃酸碱度pH6~8接近等电点时易出现假阳性第一节免疫荧光技术ImmunofluorescenceassayIFA能解决：是什么在哪里有多少荧光激发光谱发射光谱荧光效率荧光寿命荧光猝灭荧光偏振第一节免疫荧光技术荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定二、免疫荧光试验（一）原理用荧光标记物标记病毒抗原或抗体，作为分子探针，检查细胞或组织内相应的病毒抗体或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光，用荧光显微镜观察，可确定病毒种类、定位、定量。二、免疫荧光试验（二）类型荧光抗体法荧光抗原法免疫细胞（组织）化学技术二、免疫荧光试验（三）方法制备标本制备荧光抗体荧光抗体染色荧光显微镜检查二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本培养敏感细胞（细胞爬片）↓种毒↓固定、干燥丙酮二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本临床样本（非固型组织）↓涂片↓固定、干燥二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本尸检样品（3~5mm）↓↓↓脱水脱色冰冻切片印片↓↓石蜡固定、脱蜡丙酮固定、干燥二、免疫荧光试验2.荧光抗体制备制备抗体用高纯度病毒免疫动物获取血清，分离IgG，提纯家兔、绵羊、山羊高特异性高亲和力二、免疫荧光试验2.荧光抗体制备标记荧光素共价键结合抗体+荧光素↓4℃持续搅拌数小时纯化（离心、透析、过滤）二、免疫荧光试验3.鉴定制成的荧光抗体以FITC为例荧光（F）蛋白（P）结合率调整制备液至A280mm=12.87×A495mmA280mm-0.35×A495mm比值越大，抗体结合荧光素越多F/P=二、免疫荧光试验3.鉴定制成的荧光抗体测定抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验抗体特异性染色滴度：倍比稀释二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色直接法二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色间接法二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色补体法荧光标记抗补体抗体双标记法两种荧光素抗体检测两种抗原二、免疫荧光试验5.设立对照区分特异性和非特异性染色标本自发荧光对照荧光抗体对照阳性抗原对照阻断试验三、免疫荧光显微镜技术荧光显微镜利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。三、免疫荧光显微镜技术光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头三、免疫荧光显微镜技术透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。四、时间分辩免疫荧光技术Time-resolvedfluoroimmunoassayTR-FIA（一）原理自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光铕Ed3+锝Tb3+钐Sm3+镝Dy3+四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型双抗体夹心法固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型固相抗体竞争法待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。第二节酶免疫技术Enzymeimmunoassay抗原抗体反应特异性酶高效催化反应专一性第二节酶免疫技术酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶HRP邻苯二胺OPD四甲替联苯胺TMB氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶AP4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420第二节酶免疫技术酶标记戊二醛交联法过碘酸氧化法醛基酶蛋白质HRP过碘酸盐HRP醛基第二节酶免疫技术固相载体塑料制品微粒膜载体NC膜、尼龙膜第二节酶免疫技术包被与封闭包被适宜浓度蛋白质封闭二次包被填补空隙小牛血清二、酶联免疫吸附试验Enzyme-linkedimmunosorbentassayELISA酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）发生特异性反应，加入酶底物，通过酶对底物的显色反应，对待测抗原（抗体）进行定位、定性或定量分析。间接法检测抗体+++固相抗原标本酶标抗体底物显色双抗体夹心法检测抗原+++固相抗体标本酶标抗体底物显色竞争法可检测抗原、抗体YYY+YYY+YYY参考管酶标抗原YYY+YYY+YYY待测管酶标抗原抗原捕获法检测IgM抗体+++抗IgM标本抗原酶标抗体显色（含IgM）+三、免疫酶染色试验ImmunoenzymaticstainingtestIEST酶标抗体（抗原）—抗原（抗体）复合物底物有色底物三、免疫酶染色试验细胞免疫酶染色均相酶免疫测定——无需分离游离与结合的酶标记物酶标记物结合后改变酶活性非均相酶免疫测定—需分离游离与结合的酶标记物•液相：用二抗或沉淀去除游离酶标记物•固相：ELISA第三节放射免疫技术RadioimmunoassayRIA利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应特异性相结合进行定量分析放射免疫核素标记抗原与未标记抗原竞争性结合特异性抗体免疫放射核素标记抗体结合待测抗原R.S.Yalow第三节放射免疫技术125I、131I、3H、14C标记纯化鉴定放射性免疫活性第三节放射免疫技术第三节放射免疫技术放射免疫竞争法++++++++BoundFreeAgAb6/8=0.754/8=0.52/8=0.251/8=0.125B/B+F第三节放射免疫技术放射免疫以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(B＋F)与Ag的量变存在着函数关系－剂量反应曲线第四节血清学试验中和试验血凝/血凝抑制试验补体结合试验一、中和试验neutralizationtest体外将病毒与特异性抗体混合并发生反应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的方法。中和抗体一、中和试验（一）原理中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病毒失去感染力。当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。一、中和试验（二）方法步骤病毒---已知滴度，并有感染力测滴度：细胞培养，将病毒10倍稀释接种敏感细胞或动物，观察CPE或动物感染情况，确定滴定终点以CCID50或LD50表示标准病毒试验浓度：100CCID50/单位体积或100LD50/单位体积一、中和试验抗体用细胞培养法测病毒抗体的滴度：将倍比稀释的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，接种敏感细胞，观察CPE。病毒抗体滴度的确定：抗血清保护细胞免受病毒感染的最高稀释倍数的倒数。抗体滴度的含义：抑制CPE的最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。一、中和试验举例如观察结果是1：10至1：320抗血清均能抑制病毒的CPE，也就是当抗血清稀释到320倍时，0.1ml抗血清含有1个抗体单位。请问：1：160及1：40含有几个抗体单位？标准抗体浓度为20个抗体单位/0.1ml一、中和试验宿主细胞培养:观察CPE和空斑（最理想和常用）鸡胚：观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、HSV）动物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、森林脑炎病毒一、中和试验（二）方法步骤固定血清—稀释抗病毒法检测病毒及其滴度固定病毒—稀释抗血清法检测血清效价一、中和试验（二）方法步骤固定血清—稀释病毒法用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清(20个抗体单位/单位体积)混合、孵育，使二者充分反应，然后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验结果。固定血清稀释病毒法试验材料宿主:敏感细胞和动物、鸡胚标准抗病毒血清(20个抗体单位/0.1ml)病毒分离物试验步骤不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞培养液倍比稀释病毒不同浓度病毒液与等量阴性血清混合接种细胞,设正常细胞对照，CO2孵箱观察CPE中和试验病毒CCID50：当抗血清组的CCID50与阴性组之差的对数大于2,才说明中和试验阳性。固定血清稀释病毒法阴性血清病毒CCID50的计算病毒稀释度CPE孔数/接种孔数累计数CPE数存活数CPE阳性比例CPE阳性率（％）10-45/510010/10100.010-54/5515/683.010-61/5151/617.010-70/50100/100固定血清稀释病毒法距离比例＝（大于50%的CPE阳性率—50%）/（大于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率）＝（83－50）/（83－17）＝0.5lgCCID50=大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=lg10-5+0.5×lg0.1=-5.5,其反对数是10-5.5.阴性血清组的病毒CCID50为10-5.5/0.1ml。固定血清稀释病毒法阳性血清病毒CCID50的计算病毒稀释度CPE孔数/接种孔数累计数CPE数存活数CPE阳性比例CPE阳性率（％）10-25/510010/10100.010-33/5525/771.010-42/5252/729.010-50/50100/100固定血清稀释病毒法距离比例＝（大于50%的CPE阳性率—50%）/（大于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率）＝（71－50）/（71－29）＝0.5大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=lg10-3+0.5×lg0.1=-3.5,其反对数是10-3.5。阳性血清组的病毒CCID50为10-3.5/0.1ml。因抗血清组的CCID50为10-3.5，阴性血清组的病毒CCID50为10-5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分离的病毒是与中和抗体相对应的病毒。一、中和试验（二）方法步骤固定病毒—稀释血清法用于血清抗体滴度的测量。用已知病毒检测位置抗体滴度。100CCID50/单位体积的病毒+连续倍比稀释血清→孵育1h→接种敏感宿主→观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况固定病毒稀释血清法试验材料:敏感宿主标准滴定的病毒100CCID50/0.1ml急性期或恢复期血清试验步骤细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并37℃孵育1h取混合液0.2ml接种细胞,CO2孵箱观察CPE50％血清中和终点：50%细胞不产生细胞病变的血清稀释度固定病毒稀释血清法恢复期血清中和病毒的结果血清稀释度CPE孔数/接种孔数累计数CPE数无CP