第四章--消毒和灭菌

1第四章消毒和灭菌2第四章消毒和灭菌微生物学上，灭菌和消毒的含意是不同的。1.灭菌是指用物理或化学的方法，完全除去或者杀死器物表面和内部的一切微生物。2.消毒是指消灭或减少病原微生物以防止侵染，而不是消灭所有的微生物。消毒还有其他作用，如进行分离工作时，植物组织往往要经过表面消毒，目的是消灭组织表面的杂菌而保存组织内的病原菌。灭菌是微生物学研究工作的基本操作。菌类的纯培养和其他方面的工作，所用的玻璃器皿、培养基和各种操作工具如刀剪等，都要经过灭菌。灭菌方法有热力灭菌、过滤灭菌、化学灭菌和辐射灭菌等。3第一节灭菌的原理和方法利用高温杀菌是最重要的灭菌法。这个方法又可分为干热灭菌法和湿热灭菌法。一、热力灭菌热力灭菌的原理：热力灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。湿热灭菌与干热灭菌比较，湿热的效率比较高。例如，培养皿用干热灭菌要在160～170℃，时间长1～2h。，湿热灭菌则只要在121℃处理20min。4一、热力灭菌（一）干热灭菌干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。1.火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸乙醇后进行灼烧灭菌。第一节灭菌的原理和方法5一、热力灭菌2.热空气灭菌在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。即将要灭菌的器物放在电烘箱中加热，其温度可以调节，有的还有鼓风设备，使箱内的温度更加均匀。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。干热灭菌的温度一般是在160～180℃间，不宜超过180℃，常用的温度是165℃。干热灭菌的应用是很有限的。高温处理易于损坏的和含水的物品，都不能用干热灭菌。第一节灭菌的原理和方法6一、热力灭菌干热灭菌步骤：①将所要灭菌的物品包裹后放入烘箱加热，②温度达到160～170℃（常用温度165℃）计时③按照不同灭菌物品所需灭菌时间进行灭菌（一般1-2h），灭菌后待温度下降到60℃以下时才能开门，否则内外温度相差很大，易引起玻璃器皿的破碎。7第一节消毒和灭菌一、热力灭菌进行干热灭菌要注意以下问题：①物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；②灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；③在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；④电烘箱内温度未降到60℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。⑤干热灭菌温度不能超过180℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。Attention!8第一节消毒和灭菌（二）湿热灭菌*湿热灭菌分为1.高压蒸汽灭菌法,2.常压蒸汽灭菌法，加压的作用是提高蒸汽的温度。注射器和挑取孢子的玻璃针等放在沸水中煮既是一种不加压的湿热消毒方法，但一般所谓湿热灭菌主要是指高压蒸汽灭菌。9第一节消毒和灭菌（二）湿热灭菌*1.高压蒸汽灭菌法原理：高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质疑固变性而达到灭菌的目的。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。10第一节消毒和灭菌（二）湿热灭菌*1.高压蒸汽灭菌法温度和时间：一般培养基以0.1MPa，121℃灭菌20min即可。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06MPa、112℃灭菌15min，但为了保证效果，可将其他成分先行0.1MPa，121℃灭菌20min，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。而盛于大瓶内的培养基最好以0.1MPa，121℃灭菌30min。第一节消毒和灭菌（二）湿热灭菌*（1）高压蒸汽灭菌锅的用法：①检查灭菌锅水量，加水到指定标度；②将需要灭菌的物品放入灭菌锅，将盖密闭，打开放汽阀；③加热灭菌锅，等空气完全排出后（蒸汽从放汽阀有力地冲出），关闭放汽阀；④温度或压力上升到所需指标后，开始计算灭菌时间，灭菌过程保持压力不变；⑤达到需要灭菌的时间，停止加热，稍微打开放汽阀，缓慢排出蒸汽使压力慢慢下降；⑥当压力降为0,锅内外压力一致时开启锅盖，取出灭菌物品。12第一节消毒和灭菌（二）湿热灭菌*（2）使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时的注意事项①在灭菌时，锅内冷空气的排除是否完全极为重要。因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度，影响灭菌效果。13第一节消毒和灭菌（二）湿热灭菌*②灭菌后，排气的快慢要适当。排得太快，灭菌器中的培养基会沸腾而冲脱或沾湿棉花塞；排得太慢，培养基受高温处理的时间长，对有些培养基是不利的。一般来说，从排气到打开灭菌器，时间约1~2min。灭菌后，培养基应立即从灭菌器中取出。14第一节消毒和灭菌（二）湿热灭菌*2.常压蒸汽灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。由于常压，其温度不超过l00℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。15常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热100℃，30min，连续3d.第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。16二、过滤除菌许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。微孔滤膜过滤器。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。17三、辐射灭菌辐射灭菌主要采用紫外线和γ射线灭菌1.紫外线（1）紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。18第六章消毒和灭菌三、辐射灭菌（2）紫外线灭菌的局限性：紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。（3）应用紫外线灭菌的注意事项①因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。②紫外灯管应定期清洁，以保证灭菌效果。19第六章消毒和灭菌三、辐射灭菌2.γ射线采用60Co-γ射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。20四、化学药品灭菌化学药品消毒灭菌是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。植物病理学实验室中常用的化学药品有2%煤酚皂溶液（来苏尔）、0.25%新洁尔灭、0.1%升汞、3%-5%的甲醛溶液、70%的乙醇21第二节各种材料的灭菌处理玻璃器皿的灭菌可以用干热或湿热(加压蒸汽)，而以干热为主。1.玻璃器皿干热灭菌温度和时间：在烘箱中加热至160～170℃处理1h或150℃处理2h；2.玻璃器皿湿热灭菌温度和时间：高压灭菌器中121℃处理20min左右；（一）玻璃器皿的灭菌223.培养皿一般都用干热灭菌。培养皿如用纸包裹或放在铁盒内灭菌，则温度应稍增高或延长灭菌时间。4.吸管的灭菌可用高压灭菌器，但最好是用烘箱。吸管要用纸包裹，然后放在铁筒内灭菌。5.其他玻璃器皿如三角瓶和烧瓶等灭菌，可用烘箱或灭菌蒸锅，但以连续用同一方法灭菌为好，否则玻璃容易破裂或模糊。6.器皿上连有橡皮塞或橡皮管的，有的橡皮经干热灭菌会损坏，必须用高压灭菌器灭菌。（一）玻璃器皿的灭菌第二节各种材料的灭菌处理23培养基一般都是用加压蒸汽(121℃，20min)灭菌。（二）培养基的灭菌培养基灭菌的注意事项：1.试管或其他器皿中盛培养基的量不宜多，培养基量大，会造成灭菌不易完全。同时，在灭菌后放气时，培养基的温度下降要比灭菌器慢，如放气稍快，培养基盛得太满，则会因沸腾而沾湿棉花塞。第二节各种材料的灭菌处理24培养基灭菌的注意事项：2.油脂类较难灭菌。含有油脂的培养基，可将油脂单独用干热(165～175℃，1h)或以少量加压蒸汽(121℃，20min)灭菌后，加到培养基中。保存菌种的矿物油，也是用干热灭菌较好。第二节各种材料的灭菌处理25（三）土壤的灭菌土壤是比较难灭菌的。薄层的土壤要在150～170℃的烘箱内灭菌几小时。如果是用加压蒸汽，121℃要2h，134.5℃要1h。大量土壤的灭菌，最好是用大型的高压灭菌器，也有放在铁锅中炒的，炒的时候不断翻动，温度要达到120～130℃以上。第二节各种材料的灭菌处理26（四）刀、剪、铗等的灭菌分离和培养时用的工具如刀、剪、铗等，可在酒精中浸过后，再通过火焰将酒精烧去，重复3次就能灭菌。刀剪等都要擦净后再灭菌，避免直接在火上烧，不然会损坏锋口。如果需用大量的刀剪，可用纸包裹或盛于铁盒内在140℃的烘箱内处理2h，或用布包好后放在高压灭菌器内灭菌。第二节各种材料的灭菌处理