生物反应器

生物反应器（Bioreactor）生物反应器的概念•用微生物、植物、动物、人细胞或者专一性酶，通过生物方法将原料转化为特定产品的容器称为生物反应器(Bioreactor)。•胃就是人体内部加工食物的一个复杂生物反应器。食物在胃里经过各种酶的消化，变成我们能吸收的营养成分。生物反应器生物反应器光生物反应器（Physcomitrellapatens）生物反应器的概念•能够产生生物活性物质的生物体，也称为生物反应器。•生物反应器包括以下几种:细菌生物反应器；酵母生物反应器；细胞生物反应器；藻类基因工程；转基因动物生物反应器。发酵罐细菌生物反应器•细菌作为反应器，是最早使用的转基因生产技术。目前，细菌仍然作为一种廉价高效的表达重组外源蛋白的宿主在广泛使用。大肠杆菌表达目的基因遗传背景比较清楚，易于控制。另外，大肠杆菌容易培养，可以获得高产量的目的蛋白。•缺点：蛋白质高级结构不正确、无翻译后加工、无修饰等限制。表达载体•Novagen公司的PET系列载体。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（简称IPTG）是经常被用来作为乳糖操纵子的诱导物。乳糖操纵子的应用乳糖操纵子的应用最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)。胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。缺乏糖尿病，注射胰岛素。现已在细菌中生产10多种药品，例如表皮生长因子、人生长激素、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。不同目的选择不同的菌株•DH5α;•JM109;•TOP10;•BL21(DE3)……酵母生物反应器•单细胞低等真核生物、遗传背景清晰、培养条件普通、生长繁殖速度迅速、表达量高；•用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本；•我国目前肝疫苗主要还是以酵母作为反应器来生产的；•酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定。酵母生物反应器的缺点•在酵母表达系统中部分外源基因不能表达；•内部降解和多聚体形成；•蛋白质高级结构不正确、翻译后加工、修饰等不正确限制。3种酵母表达系统•酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统：酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。3种酵母表达系统•甲醇营养型酵母表达系统：巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统最为常用；•巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化作用等，其糖基化位点其他哺乳动物细胞相同，适合于生产医药用重组蛋白质。3种酵母表达系统•裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许多与高等真核细胞相似的特性，它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较少。动物细胞生物反应器•昆虫细胞；•哺乳动物细胞；•鱼类细胞。昆虫细胞生物反应器•昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)：病毒载体、昆虫细胞、宿主培养基；与细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统相比，具有易于操作和筛选，较好的转录后加工修饰以及安全等优点；缺点：昆虫细胞的蛋白质加工过程并非同高等的真核生物完全一致，最终会影响到表达产物的生物学活性。哺乳动物细胞、鱼类细胞生物反应器•表达具有天然活性蛋白的最佳宿主。•其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号,能准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键以及蛋白水解等翻译后加工过程,因而产生的完整蛋白和天然蛋白一样。•缺点：产量低、成本高、需要严格灭菌的培养条件。质粒表达载体•Invitrogen公司的pcDNA系列载体。CMV:Cytomegalovirus,能在哺乳动物细胞中表达，不具有组织或细胞特异性。细胞系和细胞株•原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（CellLine），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。•其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。家蚕丝腺生物反应器•家蚕是人工养殖的经济昆虫，蚕的丝腺作为生物反应器来表达重组的外源蛋白具有极高的商业价值与应用前景。家蚕丝腺生物反应器•存在的问题：丝腺中主要以丝蛋白分泌为主，给目的蛋白的下游分类纯化带来了困难；与杆状病毒表达系统一样存在蛋白质转录后修饰的问题；如何将外源基因稳定的转入家蚕体内，同时能高效稳定地在丝腺细胞中表达也是亟待解决的技术难关。鸡输卵管生物反应器优点：鸡具有世代周期短、低成本、繁殖力高、卵中天然存在着蛋白酶抑制剂和良好的无菌环境；•鸡的蛋清是一种相对简单的混合物，单个鸡蛋卵清蛋白含量约为3.6g，仅包括约11种主要的蛋白，因此利于纯化；•与哺乳动物相比，一些鸡蛋白的糖基化方式比哺乳动物更近似人类。鸡输卵管生物反应器•蛋清的一半蛋白来自两个卵清蛋白等位基因，其特异表达于输卵管膨大部的管腺细胞。现状：研究还处于初级阶段。乳腺生物反应器通过转基因技术将乳腺组织特异性启动子驱动的外源基因在动物乳腺组织高效表达通过乳汁分泌到体外该方式不会对动物自身机体造成损害通过回收乳汁就可以提取有重要价值的生物活性蛋白。转基因动物乳腺特异性表达的启动子•乳球蛋白(BLG)基因启动子；•酪蛋白基因调控序列，常用牛αS1-酪蛋白基因和羊β-酪蛋白基因的调控序列；•乳清酸蛋白(WAP)基因启动子；•乳清白蛋白基因启动子。乳腺生物反应器产业化•重组人抗凝血酶Ⅲ(ATryn)已经被美国FDA批准上市；•仅用几十只转基因山羊就能生产出全世界一年需求的抗凝血酶III(ATryn)，每年市值7亿美元；•5种药进入临床Ⅲ期试验；•37种进入Ⅱ期临床研究阶段。乳腺生物反应器面临的问题•生产周期长、基因整合效率不高；•转基因动物死亡率较高；•常出现不育导致转基因动物续代难。莱茵衣藻生物反应器•真核单细胞、结构简单、因序列已经完全测得,序列结构比较清楚,利于遗传操作;•培养条件简单,可以大规模培养,易于工业化生产;核转化与叶绿体转化方法成熟;•衣藻作为真核生物,可以对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰(如:正确的折叠等);•衣藻本身不带有对人体有害的生物,如病毒、细菌等,这就使得其表达的产物不会含有毒素等有害物物质,从而减少纯化步骤,大大降低成本。植物生物反应器•以植物悬浮细胞培养或整株植物为加工场所大量生产具有重要功能或药用价值的蛋白、人或动物的疫苗抗体、重要的氨基酸等；•相关植物生物反应器产品可通过种子、果实或块茎表达，便于贮藏运输和利用。利用植物生物反应器制备抗体•抗肿瘤抗体；•肿瘤疫苗；•其它抗肿瘤药物。缺点：•重组蛋白表达量低；•重组蛋白的免疫原性不够强；