CAS9技术解读

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资源描述

CRISPR/Cas9Timelineofgenomeengineeringresearch1982年,利用同源重组的方法进行基因打靶。但是效率极低,因此应用受到限制。1998年,出现了第一代人工核酸内切酶技术——锌指核酸内切酶(ZFN)技术,锌指是一类能够结合DNA的蛋白质,ZFN是锌指蛋白与核酸内切酶FokI融合形成的核酸内切酶。2010年,出现第二代人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术。TALEN由DNA结合蛋白TALE与核酸内切酶FokI融合而成。这两种技术都是通过DNA结合蛋白靶向特异DNA结合后,在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切。2012年,仅仅时隔两年,出现了Cas9技术,它是由RNA指导的Cas核酸内切酶对靶基因进行修饰的技术。CRISPR/Cas9•CRISPR/Cas9是细菌和古生菌一种特殊的防御系统,能够有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件(如质粒)对其造成的干扰。可以将CRISPR/Cas系统分为:TypeI、TypeII、TypeIII三种不同类型。三类CRISPR/Cas系统中TypeII型系统的核糖核蛋白复合物相对简单,除crRNA和tracrRNA外,只有Cas9一个蛋白。目前,产脓链球菌的TypeII型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶,已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰。因此介绍typeII。TypeII基因座以产脓链球菌的典型TypeIICRISPR/Cas为例,其基因座结构可分别三部分,5'端为tracrRNA基因。中间为一系列Cas蛋白编码基因,包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2。3'端为CRISPR基因座,由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(repeats)顺序排列组成。Cas9proteinfunction•Casnucleasehas:①RNAbindingdomain;②anα-helicalrecognitionlobe;③aPAM-interactingsite.④anucleaselobe:NHN:负责切割与crRNA互补的链RuvC:负责非互补链的切割因此,将RuvC或是NHN活性突变后Cas9只有单链切割活性,类似于切口酶Adaptiveimmunityinvolvesthreephases(作用机理)(1)CRISPR的高度可变的间隔区的获得:外来入侵的噬菌体或是质粒DNA的一小段DNA序列(protospacer)被整合到宿主菌的基因组,整合的位置位于CRRSPR的5'端的两个重复序列之间(repeats)。(2)CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工):CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPRRNA(pre-crRNA),然后由tracrRNA指导,在Cas蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA单元,这些小RNA即为成熟crRNA,由一个间隔序列和部分重复序列组成.(3)CRISPR/Cas系统发挥活性,对外源遗传物质的干扰:成熟的crRNA与特异的Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物,再与外源DNA结合并扫描到外源DNA,寻找其上的靶序列,crRNA的间隔序列与靶序列互补配对,外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。PAM(protospacer-adjacentmotif)PAM是由3个成对碱基构成的序列,靠近靶DNA序列3’末端,可以促进靶序列的识别。化脓链球菌Cas9作为基因组修饰通用的工具,特异识别NGG和NAG的PAM序列(前者效率更高)。RNA-DNA异源双链体的形成是从PAM位点开始的,从而使得Cas9发挥活性,对DNA链进行切割。避免细菌自身免疫的发生宿主菌利用crRNA与靶序列配对结合介导外源DNA切割,而crRNA本身是由宿主菌的基因组为模板转录出的pre-crRNA经加工后形成的,这就是说相同的靶序列也存在于宿主的基因组中,那么CRISPR/Cas系统应该有一套机制将自身序列和外源的靶序列区分开。宿主菌的CRISPR基因座位的间隔序列(spacer)临近位置不存在PAM,而靶序列临近有PAM,在PAM序列crRNA不能配对,只有不完全的配对才允许核糖核蛋白复合体发挥切割活性,,通过这样的机制CRISPR/Cas系统避免自我免疫。UseofCRISPR/Cas9forgenomeeditingtracrRNA:crRNA改造成一条嵌合的sgRNA,发挥tracrRNA和crRNA的功能,包括两部分:DNA互补序列(一般20核苷酸),相当于crRNA;双链结构,可以结合Cas9,相当于tracrRNA。在sgRNA指导下,Cas9内切酶对特定位点的DNA进行切割,产生DSB,然后细胞会借助同源定向修复(HDR)或者非同源末端连接机制(NHEJ)对断裂的DNA进行修复。对于HDR,当提供同源模板,可产生精确的序列修饰,插入特定序列;对于NHEJ,可以导致插入或缺失Off-targeteffectOff-targeteffect:thetoleranceofCas9tomismatchesinthesgRNAsequence.脱靶效应与诸多因素有关,如sgRNA自身的特征、浓度及其与Cas9的相对量等。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于sgRNA与靠近PAM(NGG)处10-12bp碱基(seedsequence)的配对,其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响较小,而我们知道,要想在一个基因组中产生特异性位点至少需要16个碱基的配对才可实现特异。研究表明CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性,核心序列只有11bp与基因组位置配对的情况下仍然被切割成功,说明该技术可以发生非特异性切割,引起基因组非靶向位点的突变,此脱靶现象的存在使得CRISPR/Cas9在临床应用上可能存在无法避免的安全隐患,同时使基础研究引入很多不确定性,所以Cas9技术在临床应用和科学研究中受到很大局限。使用whole-genomesequencing或其他的方法可以设计高特异性的sgRNA,从而极大限度的避免脱靶效应。有待研究。Deliverymethods(1)electroporation(电穿孔)(2)nucleofection(核转染)(3)lipofectamine-mediatedtransfection(脂质体转染)(4)non-replicatingplasmidDNA(5)viralvector:adenoviralvector(腺病毒载体)adeno-associatedviralvectorlentiviralvector(慢病毒载体)优点:不会插入突变;成功率高(6)microinjection(CRISPR-relatedRNAsand/orplasmidDNA):havebeendeliveredintoembryosofzebrafish,fruitflies,miceandratsOptimizationoftheCRISPR/Cas9system(efficiency&specificity)1.改造Cas9:通过点突变的方法使RuvC或NHN结构域失活,这样Cas9只有单链切割活性,类似于切口酶,产生single-strandedbreaks(SSBs)。这样,单链缺口就会通过高保真性的碱基切除修复方式进行修复。Adouble-nickingstrategy:用一对sgRNAs分别引导上述Cas9变体,从而在靶位点产生DSB。如果产生了脱靶效应,单链缺口会被修复,从而提高了Cas9的特异性。2.createfusionsoftheFokInucleasedomainto“dead”Cas9(dCas9):dCas9内切活性丧失,仍能与靶区域结合。sgRNAsfuseddCas9-FokIsimultaneouslybindtargetsitesresultcleavagebytheFokIdomainsOptimizationoftheCRISPR/Cas9system1.theconversionofCas9:inactivatingRuvCorNHNdomains——createssingle-strandedbreaks(SSBs)——baseexcisionrepairpathwayAdouble-nickingstrategy:(offsetsgRNApositions)2.createfusionsoftheFokInucleasedomainto“dead”Cas9(dCas9):dCas9内切活性丧失,仍能与靶区域结合。sgRNAsfuseddCas9-FokIcansimultaneouslybindtargetsitesresultcleavagebytheFokIdomains3.alterthelengthofthesgRNA:ShortersgRNAstruncatedbytwoorthreenucleotidesatthe5′-targetingregioncanreduceoff-targeteffects.通过靶序列的5’端的2或3个核苷酸将sgRNA截短,从而降低脱靶效应。EnzymaticconcentrationisalsocrucialforCas9specificity.Highconcentrationsoftheenzyme(Cas)havebeenshowntoincreaseoff-targetsites,lowerconcentrationsofCas9increasespecificityanddiminishon-targetcleavageactivityApplicationofCRISPR/Cas9enomeeditingindisease•UseofCRISPR/Cas9forthestudyofgenefunction•UseofCRISPR/Cas9forcorrectionofgenemutationsUseofCRISPR/Cas9forthestudyofgenefunctionproducegeneknockoutsstudygenefunction应用举例:Cancer癌症虽然研究很多,但并不知道具体是由于哪个突变引起了癌症。研究人员用Cas9技术,同时导入针对潜在位点的多个sgRNA,敲除多个基因位点产生突变,从而模仿疾病的产生。比如通过敲除肿瘤抑制基因PtenandApc,得到小鼠的肺癌模型;通过突变在病人体中突变的基因调控元件、转录因子、细胞因子等产生急性骨髓白血病模型。由此,我们得知利用CRISPR/Cassystem可以通过一步产生多基因突变,从而提供了在体内研究基因功能的方法,并且通过改造可以得到一系列癌症模型。利用CRISPR/Cassystem还可以产生tumor-associatedchromosomaltranslocations(染色体易位),通过两个染色体的非同源连接产生致癌作用。随着theHumanGenomeProject的完成,研究每个基因的功能成为主要的任务,而Cas9修饰特异性基因座的特性为研究全基因组的基因功能提供了有效的工具。UseofCRISPR/Cas9forcorrectionofgenemutations治疗人类基因疾病最直接的方法就是通过基因治疗的方法修正引起疾病的突变基因。近来发现,CRISPR/Cassystem可以用来在人类干细胞进行快速而精确的基因组编辑,这为基因治疗提供新的方法。单基因遗传疾病:cysticfibrosis(囊肿性纤维化)——修正CFTR基因;humanhemoglobinbeta(HBB)gene突变引起的β-Thalassemia(地中海贫血);利用Cas9治疗小哺乳动物的基因疾病:利用受精卵注射Cas9mRNAandsgRNAs,可以一步产生带有目标突变的miceorrats,然后通过HDR产生修复的可遗传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