葡聚糖的应用

11,3-β-D-葡聚糖检测与临床李智山襄阳市中心医院医学检验部2AIDS侵袭性真菌感染率上升—3严重真菌感染迅速上升势头危重病人的存活期延长延长了真菌感染的高危期使此类患者业已增加的人数进一步扩大医学和相关科学的进步是日益严重的威胁！4真菌感染的危险因素：中心静脉插管尿道插管广谱抗生素气管插管腹部外科肠胃外营养营养不良住院时间感染之前定殖5侵袭性真菌感染条件致病性真菌念珠菌病曲霉病隐球菌病其他6诊断方法影像学组织病理学/细胞学培养血清学分子生物学方法：PlateliaAspergillusELISAFungitellassayPCR（unavailable）传统的方法7真菌病实验室诊断主要内容准确、快速检出真菌病原体真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学8镜检和培养方法敏感性低血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难培养时间长有些标本采集困难9非培养方法优点快速报告结果敏感性提高取材简便多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性定量检测可判断感染严重程度及疗效评估10非培养诊断的方法简介真菌细胞壁成分（1-3）-β-D-葡聚糖检测（G试验）真菌抗原检查半乳甘露聚糖（galactomannan)抗原（GM)甘露聚糖(mannan)抗原隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）真菌特异的代谢产物D-阿拉伯糖醇真菌DNA的检测11临床诊断、拟诊的微生物学1合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养≥2次分离到同种真菌2支气管肺泡灌洗液(BALF)经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性3痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌4乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性5G实验连续两次阳性6GM实验连续两次阳性12侵袭性真菌感染的诊断标准EORTC/MSG2008修订版宿主因素临床特征病原学真菌镜检真菌培养组织病理学检查血清学检查方法（间接证据）CSF隐球菌抗原阳性——确诊GM-test,G-test——临床诊断ClinicalInfectiousDiseases2008;4613（1,3）-β-D-葡聚糖检测14b1,6葡聚糖磷脂双分子层几丁质麦角固醇b1,3葡聚糖合成酶mannoproteinsβ1,3真菌细胞膜、壁结构羊毛固醇C－14去甲基化酶14位还原和7－8位异构酶角鲨烯环氧化酶151,3-β-D-葡聚糖结构葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，是真菌细胞壁上的特有成分以1,3-β-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链以分支状1-6-β-D葡萄糖残基作为侧链几丁质麦角固醇葡聚糖B13，葡聚糖合成酶糖蛋白类161,3-β-D-葡聚糖特性对热极为稳定，高压121℃并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡氏肺孢子菌不可检测隐球菌、接合菌（根霉/毛霉等）17“G”试验缘何而来？18光度（浊度）法动态浊度法终点浊度法光度（显色）法动态显色法终点显色法定量检测1-3-β-D-葡聚糖的方法19G试验的基本原理1-3-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎的变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物发生颜色变化，故称G试验。（1-3）b-D-GlucanTAL-RM(鲎试验非内毒素反应物)G因子活化G因子凝固酶原凝固酶显色寡肽寡肽+显色基团（黄色）（光度法测定）试验反应机理图：20分析前注意事项采用无热原采血管抽血后2h内送检血标本4-8℃最多存放48h检测环境应保持清洁211,3-β-D-葡聚糖相关影响因素以下情况可出现假阳性：使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；链球菌血症；操作者处理标本时存在污染；使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。221,3-β-D-葡聚糖检测临床价值早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗效高，价格适宜的药物提供准确的依据。评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚糖浓度变化，评价选用药物的有效性。监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。动态观察：易感人群，监测临床疗效。23曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）Figure1-10Noncompetitivesandwichmethodofimmunoassay24中性粒细胞减少症患者40例（发展为曲霉菌病的高危人群）该研究选择1,3-β-D-葡聚糖（BG）和半乳甘露聚糖（GM）两个指标用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者BG和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾病,但BG可早于GM升高.BG和GM联合检测用于曲霉菌病的诊疗,其特异性和阳性率均为100%.例1CarmenPazos,JosePonton,etc.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Jan.2005结论：BG和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真菌感染,并将单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小.1,3-β-D-葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检测比较：用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病25120名儿童7月—8岁1,3-β-D-葡聚糖定量检测结果：中位数32pg/ml平均值68±128pg/ml高值5例12岁348pg/ml2岁374pg/ml14岁491pg/ml13岁754pg/ml14岁947pg/ml94例(78%)60pg/ml8例(7%)60-79pg/ml18例(15%)180pg/ml例2P.BrianSmith,DanielK.Benjamin,Jr,etc.CLINICALANDVACCINEIMMUNOLOGY,July2007结论•研究数据显示,健康儿童的1,3-β-D-葡聚糖水平高于健康成人.•该指标用于儿童感染性疾病的诊断应慎重,1,3-β-D-葡聚糖在儿童群体的正常值区间有待进一步研究.儿童1,3-β-D-葡聚糖水平研究26收集患者82例侵袭性真菌感染组22例其他真菌感染组镰刀菌/接合菌/丝孢菌感染17例念珠菌感染23例对照组(血液肿瘤患者非真菌感染)20例414份血清标本检测GM409份血清标本检测BG侵袭性曲霉菌病患者在留取血清标本前已接受抗真菌药物治疗(包括聚烯类、氮杂茂类、棘球白素类等)半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖用于诊断血液肿瘤患者烟曲霉菌感染敏感性较低R.Y.Hachem,D.P.Kontoyiannis,etc.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Jan.2009结论对于血液肿瘤患者合并侵袭性真菌感染的诊断,BG的敏感度优于GM.例327例41,3-β-D-葡聚糖和抗白色念珠菌细胞壁抗原的IgG亚型抗体用于系统性念珠菌感染诊疗系统性念珠菌病患者IgG亚型体液水平升高抗细胞壁碎片IgG1抗体(IgG1-CW)抗磷酸肽甘露聚糖片段IgG2抗体(IgG2-PPM)系统性念珠菌病患者IgG1-CW/IgG2-PPM比值升高结论1,3-β-D-葡聚糖以及IgG1-CW、IgG2-PPM可用于早期诊断系统性念珠菌病.1,3-β-D-葡聚糖与IgG亚型相结合检测可提高阳性预测值，有效指导早期抗真菌药物治疗.N.Kondori,L.Edebo,etc.CLINICALANDDIAGNOSTICLABORATORYIMMUNOLOGY,Mar.200428血浆1,3-β-D葡聚糖检测对血液病患者侵袭性真菌感染的诊断价值本研究收集疑为IFI的血液病患者血浆标本162例,其中化疗后患者85例,造血干细胞移植后患者77例。按照欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)诊断标准,所有病例中有确定诊断2例,临床诊断18例,拟诊75例,排除诊断67例。结果表明:以20ng/ml为诊断界值,G试验的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为75%、91%、72.4%和92.4%。例5刘芳,吴彤,等.中国实验血液学杂志JournalofExperimentalHematology200929血浆1,3-β-D葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究例6赵勇,王红,等.中国真菌学杂志2007年8月第2卷第4期统计学结果提示血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断的准确性优于单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否阳性对深部真菌感染的判断。AUC95%置信区间葡聚糖0.8870.795-0.979真菌培养0.8400.744-0.936真菌涂片0.8330.738-0.927用于诊断深部真菌感染各指标ROC曲线下面积30血清1,3-β-D-葡聚糖检测在念珠菌菌血症诊断中的价值例7对2007年1月至2009年4月的25例念珠菌菌血症患者、60例细菌菌血症患者、25例念珠菌口咽定植者、20例健康体检者的血清1,3-β-D-葡聚糖含量进行比较分析。念珠菌菌血症组的血清1,3-β-D-葡聚糖含量为115.2±42.3ng/L,明显高于其他各组,其他各组间的血清1,3-β-D-葡聚糖含量无显著差异。结论:血清1,3-β-D-葡聚糖的检测是诊断念珠菌菌血症的有效指标。刘英其.中国卫生检验杂志2009年9月第19卷第9期31血清1,3-β-D-葡聚糖检测在念珠菌菌血症诊断中的价值例7四组间比较:F=119.493,P0101;细菌菌血症组、念珠菌口咽定植组、健康对照组三组间的比较:F=3104,P0.105;念珠菌菌血症组与细菌菌血症组、念珠菌口咽定植组、健康体检组的两两比较:P值均0.01;细菌菌血症组Vs念珠菌口咽定植组、细菌菌血症组Vs健康对照组、念珠菌口咽定植组Vs健康对照组的两两比较:P值均0.05.刘英其.中国卫生检验杂志2009年9月第19卷第9期32血浆1,3-β-D-葡聚糖与抗深部白色念珠菌感染药物疗效关系的实验研究例8李世荣,王红,等.临床和实验医学杂志2007年第6卷第6期本文采用110只小鼠随机分成3组,空白对照组、模型组、氟康唑组,建立深部白色念珠菌感染的动物模型。定量检测血浆中1,3-β-D-葡聚糖的含量,双肾组织匀浆液培养计数菌落数。用于探讨深部真菌感染小鼠血浆1,3-β-D-葡聚糖水平与抗真菌药物疗效的关系。各处理组不同时间点血浆1,3-β-D-葡聚糖的比较组别治疗前治疗第1天治疗第3天治疗第5天模型组4791.47±4415.995397.00±4640.993537.98±4259.212355.31±3663.52氟康唑组3978.09±3500.152976.15±3953.12662.60±1665.5417.87±15.03对照组8.95±6.0633血浆1,3-β-D-葡聚糖与抗深部白色念珠菌感染药物疗效关系的实验研究例8李世荣,王红,等.临床和实验医学杂志2007年第6卷第6期治疗前模型组血浆(1→3)-β-D-葡聚糖水平明显高于空白对照组,说明血浆1,3-β-D-葡聚糖水平异常升高可以反映深部真菌感染的存在。氟康唑组血浆1,3-β-D-葡聚糖水平随着治疗逐渐减低,从治疗第5天开始与模型组相比,血浆1,3-β-D-葡聚糖水平差异具有统计学意义(P0