第5章-DNA的损伤修复及突变

1第五章DNA的损伤、修复和突变2第一节DNA的损伤3根据受损的部位，DNA损伤可以为两种：碱基损伤DNA链的损伤DNA损伤：一切使DNA结构和功能发生改变的DNA变化，都可称为基因的损伤。4•DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要；•修复DNA损伤的能力是生物能保持遗传稳定性所在；•DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，因此生物才会有变异、有进化。DNA损伤修复的重要性：5细胞内在的因素和环境中的因素都可能导致DNA损伤，根据损伤的原因可以分为：•DNA分子自发性损伤•物理因素导致的DNA损伤•化学因素导致的DNA损伤6一、DNA分子自发性损伤1.碱基的异构互变2.碱基的脱氨基作用3.脱嘌呤与脱嘧啶(碱基丢失)4.活性氧引起的碱基修饰与链断裂71.碱基的互变异构DNA每种碱基有几种形式，称互变异构体，异构体中原子的位置及原子之间的键有所不同。碱基各自的异构体间可以自发发生变化（烯醇式与酮基间互变）;A=CT=G上述配对发生在DNA复制时，会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误损伤.8同型异构体转换=O-OH9同型异构体转换-NH2-NH1011异构互变造成的复制损伤122.碱基的脱氨基作用碱基的环外氨基自发脱落，C变为U，A变为次黄嘌呤（I），G变为黄嘌呤（X）。复制时，U与A配对、I和X都与C配对会导致子代DNA序列的错误变化。13143.脱嘌呤与脱嘧啶(碱基丢失)自发水解使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落。哺乳类动物细胞，在30ºC下，20h内DNA链自发脱落嘌呤约1000个，嘧啶约500个。154.活性氧引起的碱基修饰与链断裂细胞呼吸的副产物O2-,H2O2造成DNA损伤，产生一些碱基修饰物（胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等），还可引起DNA单链断裂等损伤;这些损失的积累可导致老化。1617二、物理因素引起的DNA损伤1.紫外线（UV）引起的DNA损伤2.电辐射引起的DNA损伤181.紫外线（UV）引起的DNA损伤DNA受到大剂量紫外线（260nm）照射时，同一条链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体；TT,CC,CT之间都可形成二聚体。复制时，此处产生空耗过程，DNA不能复制，细胞不能分裂，导致凋亡。19紫外线引起的DNA损伤－－最易形成胸腺嘧啶二聚体（TT）202.电辐射引起的DNA损伤碱基变化细胞中的水经辐射解离后产生大量OH-自由基，使DNA链上的碱基氧化修饰、形成过氧化物的、导致碱基环的破坏和脱落等。脱氧核糖变化脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂。21DNA链断裂脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致DNA链断裂。一条链断裂称单链断裂（singlestrandbroken）；DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂（doublestrandbroken）。22交联（binding）同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间以共价键结合；DNA与蛋白质之间也以共价键相连；组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA以共价键连接。交联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础，会影响细胞的功能和DNA复制。231.碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤；2.烷化剂对DNA的损伤；3.嵌合剂对DNA的损伤。三、化学因素引起的DNA损伤241.碱基类似物对DNA的损伤某些化学物质和正常的碱基在结构上类似，有时会替代正常碱基而掺入DNA分子，一旦这些碱基类似物进人DNA后，由于它们的配对能力不同于正常碱基，便引起DNA复制过程中其对应位置上插入不正确碱基。25例如5-溴尿嘧啶（BU）和5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）是T结构类似物。细菌在含BU的培养基中培养时，部分DNA中的T被BU取代，BU有两种互变异构体，一种是酮式结构（第6位上有一个酮基），它可以代替T而掺入DNA，并与A配对；当BU发生互变异构成为烯醇式（第6位上是一个羟基）后，就容易和G配对。通常以酮式存在，有时也以烯醇式存在。当BU先以酮式掺入DNA，继而又变成烯醇式时，进一步复制使DNA中A-T对变成G-C对。同样道理也引起G-C向A-T的转换，BU可以使细菌的突变率提高近万倍。26除BU外，还有5-溴脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶及它们的脱氧核苷。另一种被广泛应用的碱基类似物是2-氨基嘌呤（2-AP），是一种腺嘌呤A类似物，可和胸腺嘧啶T配对。可再和胞嘧啶C配对，产生A-T、G-C的转换，或2-AP以和胞嘧啶C配对形式进入DNA后再和胸腺嘧啶T配对后产生G-C、A-T的转换。272.烷化剂引起的DNA损伤（特异性错配）某些诱变剂不掺入DNA，而通过改变碱基的结构从而引起特异性错配，如烷化剂（是一类亲电子的化合物，具有一个或多个活性烷基）。它们的诱变作用是使DNA中的碱基烷化。活性烷基不稳定，能转移到其他分子的电子密度较高的位置上，并置换其中的氢原子，使其成为不稳定的物质。烷化剂的种类很多，常见的有甲磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（NG）和芥子气等。28EMS能使鸟嘌呤的N位置上有乙基，成为7一乙基鸟嘌呤。与胸腺嘧啶配对，故能使G-C转换成A-T。烷化剂的另一作用是脱嘌呤。例如烷基在鸟嘌呤N位上活化糖苷键引起断裂，使嘌呤从DNA链上脱掉，产生缺口。复制时，与缺口对应的位点上可能配上任一碱基，从而引起转换或颠换；而且去嘌呤后的DNA容易发生断裂，引起缺失或其他突变。293.嵌合剂的致突变作用嵌合染料是另一类重要的DNA修饰剂。包括吖啶橙（acridineorange）、原黄素（proflavin）、溴化乙锭（EB）等染料。这些试剂为平面分子，其分子大小与碱基对大小差不多，可以嵌入到DNA双链碱基对之间，在嵌入位置上引起单个碱基对的插入或缺失突变。嵌合染料也能嵌入单链DNA的碱基之间，这些突变都会引起阅读框的改变，造成移码突变。30荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光。体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色31DNA分子上可能遭遇到的各种损伤32第二节DNA的修复33•为了保证遗传信息的高度稳定性，生物细胞在进化过程中形成了一系列多步骤的修复机制。•目前对DNA损伤和修复的研究还不多，仅限于辐射-生物反应方面。34一.错配修复一旦在DNA复制过程中发生错配，细胞能够通过准确的错配修复系统识别新合成链中的错配并加以校正，DNA子链中的错配几乎完全能被修正，充分反映了母链序列的重要性。因此，错配修复系统对DNA复制忠实性有很大的贡献。35•错配修复可以纠正几乎所有的错配。此外对于对于插入或删除引起的DNA遗传信息的改变也有作用。•错配修复是以底物链上的信息为模板进行的，因此这个系统有区分底物链和新合成链的机制，细胞通过识别DNA链的甲基化状态来区分底物链和新合成的链。整个修复过程可以分为识别、切除和修补等步骤。36•Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺甘酸的N6位甲基化；•一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始DNA合成前的几秒至几分钟内被甲基化；•此后，只要两条DNA链上碱基配对出现错误，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5‘位置切口子链，再根据错配碱基相对于DNA切口的方位启动修复途径，合成新的子链DNA片段。37DNA的半甲基化修复机制：错配修复系统GATCsequencesaretargetsfortheDammethylaseafterreplication.Duringtheperiodbeforethismethylationoccurs,thenonmethylatedstrandisthetargetforrepairofmismatchedbases.381.碱基切除修复（base-exciserepair，BER）一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变。•腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对；•鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对；•胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对；二.切除修复39•BER可以去除因脱氨基或碱基丢失，无氧射线辐射或内源性物质引起的环氮类的甲基化等因素产生的DNA损伤。•BER是维持DNA稳定的重要修复方式，其步骤是N-糖苷键水解，从而切除发生变化的碱基。碱基释放过程是由DNA糖苷酶催化的。40胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶41如果复制发生就会产生一个突变42糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-β-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。43由AP磷酸内切酶将受损核甘酸的糖甘-磷酸键切开44DNA连接酶连接利用DNA聚合酶I切除损伤部位，补上核苷酸452.核苷酸切除修复（nucleotideexciserepair,NER）•当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由NER负责修复。•NER的关键特征是对损伤的DNA链的两端进行切割。•NER可以修复UV照射形成的嘧啶二聚体以外，还能消除体内产生的各种嘌呤和嘧啶加合物。•NER在已研究过的真核生物中都很相似，说明其在进化过程中高度保守。461）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位；2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸；3）DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链；4）DNA连接酶将切口补平。47识别损伤部位损伤的两边切除几个核苷酸（核酸外切酶）DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链DNA连接酶将切口补平48切除修复(excisionrepair)“切－补－切－封”49切除修复（excisionrepair）系统在几种酶的协同作用下，先在损伤的任一端打开磷酸二酯键，然后外切掉一段寡核苷酸；留下的缺口由修复性合成来填补，再由连接酶连接。由于这些酶的作用不需可见光激活，也叫暗修复。切除修复不仅能消除由紫外线引起的损伤，也能消除由电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤。切除修复一般发生在下一轮DNA复制之前，又称复制前修复。50三.直接（回复）修复直接修复是指不需要移去任何碱基或核苷酸就可以将损伤逆转到正常状态的修复。可分为以下几种：1）光复活酶学光复活过程是修复UV导致的环丁烷嘧啶二聚体的直接机制，这种修复具有高度的专一性。51光修复（photoreactivation）——（主要对胸腺嘧啶二聚体而言）修复机制：在可见光（300~600nm）活化之下，由光复活酶（photoreactivatingenzyme，PR）催化胸腺嘧啶二聚体分解为单体。参与的酶：光复活酶（PR）52光复活酶修复：波长400nm可见光激活(a)(b)(c)53光复活是针对紫外线引起DNA损伤而形成的胸腺嘧啶二聚体，在损伤部位进行修复的修复途径。光复活作用在可见光的活化下，由光复活酶（PR)，又称光解酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体。PR酶先与DNA链上的胸腺嘧啶二聚体结合成复合物；复合物以某种方式吸收可见光，并利用光能切断二聚体之间的两个C-C键，使胸腺嘧啶二聚体变为两个单体，恢复正常，而后PR酶就从DNA上解离下来。54过去认为，光复活酶存在于细菌和低等真核生物体内。研究发现在鸟类和有袋类中也有存在。B．M．Sutherland（1974）报道，在人类白细胞中发现光复活酶。随后发现存在于人类的成纤维细胞和淋巴细胞中。说明这种酶在生物界分布广泛，这一修复机制在哺乳动物中也起重要作用。光复活的修复功能虽然普遍存在，但主要是原核生物中的一种修复方式。552）单链断裂修复DNA单链断裂是损伤的一种常见形式，其中有一部分单链断裂是通过DNA连接酶的简单重接而修复的。DNA连接酶能催化DNA双螺旋结构中的一条链上缺口处的5’磷酸末端与相邻的3’羟基末端形成3‘，5’-磷酸二酯键，连接需要的能量来自NAD+（E.coli）或ATP（动物细胞），DNA连接酶在各类生物的各种细胞中普遍存在，而且修复反应很容易进行。563）烷基转移修复•烷化剂