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陶瓷羟基磷灰石（CHT）原理与技术一、分离机理：羟基磷灰石具有独特的分离机理，是唯一直接用于蛋白质和核酸纯化的无机层析填料，高度耐碱，生物安全性最高。其中PO43－离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，可由NaCl浓度梯度或磷酸钠浓度梯度洗脱，其中的Ca2＋离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合，该结合方式对NaCl不敏感，可由磷酸钠浓度梯度洗脱。因此该填料既可以用磷酸钠单梯度洗脱，也可以采用NaCl梯度洗脱后以低浓度磷酸钠缓冲液平衡，再以磷酸钠浓度梯度洗脱的双梯度洗脱模型，以达到更高的分辨率。二、羟基磷灰石类型选择：羟基磷灰石因陶瓷化工艺不同分为2种类型：I型和II型，I型对蛋白质具有更大的保留，对普通蛋白质具有更大的动态载量，主要纯化大部分蛋白质（分子量一般在100kd一下）；II型由于孔径较I型大，因而对抗体和部分重组疫苗等大分子量蛋白质的动态载量更高，而对HSA几乎无保留，因而更适合于抗体的纯化，同时II型对核酸具有更大的保留，能够分辩单、双链、是否超螺旋等各种高级结构的核酸，因而也适合纯化核酸。三、羟基磷灰石的分离策略：由于羟基磷灰石层析的上样对NaCl不敏感，更适合作为中间纯化和精纯的常规步骤，经第一步离子交换捕获得到的样品不需作任何脱盐处理即可直接上样纯化，具有更高的分辨率。因此，陶瓷羟基磷灰石（CHT）更多的是用于蛋白质分离纯化的中间步骤，一般第一步用离子交换或亲和捕获得到的组分即可直接上样到CHT层析柱上，可进行高分辨率的分离，获得高纯度的组分。层析条件的摸索参数主要有：型号，磷酸盐缓冲液的不同pH，单梯度，双梯度等等。双梯度洗脱模型不同类型CHT陶瓷羟基磷灰石在不同pH下不同蛋白质的保留时间（min）四、CHT羟基磷灰石层析初始条件设定与条件摸索羟基磷灰石最常用的缓冲液是磷酸钠缓冲液，也可用磷酸钾缓冲液，所有梯度洗脱体积一般为10－20个柱床体积，一般起始条件如下：1、单梯度洗脱：平衡液（A液）：5mMPB，pH条件摸索：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或以上洗脱液（B液）：400mMPB，梯度一般为0——30％B、50％B、70％B、100％B等。可在单梯度缓冲液（A液和B液）中加入低浓度NaCl已优化分离效果，主要作用是用Na离子封闭CHT骨架上的磷酸根离子，避免带负电蛋白质与骨架上的磷酸根离子排斥而影响载量，所以加入一定浓度的NaCl有利于提高带负电蛋白质在CHT上的载量，一般加入到20－50mM的NaCl。2、双梯度洗脱：平衡液（A液）：5mMPB，pH7.0、7.5、8.0洗脱液I（BI液）：A液含1MNaCl，梯度可从0——50％B，洗脱液II（BII液）：400mMPB，梯度一般为0——30％B、50％B、70％B、100％B等3、CHT的再生和清洗：CHT是唯一用于蛋白质纯化的无机填料，所以高度耐碱，一般的再生和清洗方法如下：再生：500mM磷酸钠缓冲液或400mM磷酸三钠溶液，3－5CV，重新平衡即可。在位清洗和消毒：1－2MNaOH或KOH溶液，3－5CV在位清洗。保存：0.1-1MNaOH或20％乙醇，可在位长期保存。五、应用实例1、CHT-I纯化重组α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）图1CHT-I柱纯化α1-AT。柱尺寸：7×52mm(10ml)；上样量：5.0ml；BufferA：10mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）；BufferB：400mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）；梯度：0-5%B和5-30%B各5个柱体积，30-100%B10个柱体积；流速：2.5ml/min。分部收集组分为1.5ml，收集如下：收集组分I-VIII分别为：运行组分（图上方轴）12-17、23-24、42-49、49-50、51-53、54-58、69-71和74-77。绿条框指示为α1-AT洗脱液。图2图1中收集组分的SDS-PAGE结果。泳道1：标准（从上到下，203、118、86、51.6、34.1、29、19.2、7.5kD）；泳道2：上样液；泳道3-10：分别为图1中之收集组分I-VIII蛋白迁移位置用标准确定（未示），分离胶为15%丙烯酰胺，Coomassie亮蓝R-250染色