【生物信息学第二版】非编码RNA与复杂疾病

生物信息学第十二章非编码RNA与复杂疾病北京大学崔庆华哈尔滨医科大学李霞、徐娟生物信息学人类基因组的蛋白质编码区的总和占总基因组长度为1％～2％，那么其他98％的基因组有什么功能呢（junkdna）？（1）42％的基因组是插入编码序列的内含子序列；人类基因平均每个基因有7个内含子。但这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？（2）其他55%的基因组的功能是什么？【注：90%以上的基因组都是转录的！】人类基因组草图带给科学家们的困惑人类基因组绝大部分都被转录成RNA，细胞内非编码RNA的数量是编码RNA的上百倍。这促使许多科学家认为生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码RNA内，而非编码序列内。non-codingRNA,ncRNA不能翻译成蛋白的功能性RNA分子Housekeepingnon-codingRNA•tRNAs、rRNAs、snRNAsetc.Regulatorynon-codingRNA•smallnon-codingRNAsiRNA、miRNA、piRNAetc.•Longnon-codingRNA（lncRNA，200nt）第一节引言Section1Introduction随着ncRNA在复杂疾病中的研究深入，研究者发现其在疾病的发生发展过程中起着巨大的作用，其功能异常能够导致各种人类复杂疾病的发生。这将使ncRNA可能成为疾病诊断、预后的新的生物学标记（biomark），并为更进一步理解复杂疾病的发病机理提供了新的手段。第二节非编码RNA与其靶基因Section2Non-codingRNAsandTargets（一）miRNA的发现一、miRNA概述miRNAwasfirstdiscoveredin1993byVictorAmbrosatHarvard（lin-4）ThesecondmiRNALet-7wasdiscoveredin2000byFrankSlackasapostdocatHarvard（GaryRuvkunlab）ThediscoveryofmiRNAsVictorAmbrosGaryRuvkunmicroRNAshadbeenneglectedforsomanyyearsbecauseoftheirsmallsize.Theunderlyingreasonis:peopleneverdreamthatsmallRNAswillhaveimportantbiologicalroles.ThenumberoftheidentifiedmiRNAsisgrowingrapidlyinrecentyears.Release21（July2014）ofthemiRBasedatabasehaveadded4196newhairpinsequencesand5441newmatureproductsRelease20contains24521entriesrepresentinghairpinprecursormiRNAs,expressing30424maturemiRNAproducts,in206species.ThesemiRNAsarefromprimates,rodents啮齿类,birds,fish,worms,flies,plantsandviruses.ThedataarefreelyavailabletoallthroughthewebinterfaceatSincearound2007,theoverwhelmingmajorityofmicroRNAsdepositedinmiRBasehavebeenpredictedfromsmallRNAdeepsequencingexperiments.miRNA的生物合成过程maturemiRNAPrecursormiRNAPrimarymiRNAmiRNAgene转录剪切剪切miRNA（二）miRNA的生物合成RNApolyII/IIIDroshaDicer几百~几千碱基约70~90碱基约22碱基miRNA例子ThemiRNAgenesandStructureofpri-miRNAsPri-miRNAsbearthe5’capand3’poly（A）tails（三）miRNA的特点、作用机制及分类microRNA命名规则hsa-miR-181a-2*hsa人，mus小鼠，rat大鼠let，lin,mir，miR,181：编号，按注册顺序a：与已注册的miRNA序列高度同源2:由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA,则在后面加上阿拉伯数字以区分*：如果一个前体的2个臂分别产生miRNA,则根据克隆实验,在表达水平较低的miRNA后加“*”;或进行如下命名hsa-miR-188-5p（或hsa-miR-188-3p）•5p：表示从5‘端的臂加工而来；3p：表示从3‘端的臂加工而来hsa-mir-188二级结构hsa-miR-188-5phsa-miR-188-3p5’3’miRNA/miRNA-starVS-5p/-3pthedominantstrandcouldchangeindifferentbiologicalsettingsleadingtodifferentnamesdescribingthesamemolecule5parm（placenta）tothe3parm（heart,liver,andkidney）物理位置特点•miRNA基因以单拷贝、多拷贝和基因簇等多种形式存在于基因组中。•miRNA簇（miRNAclusters）是指在染色体上彼此紧密相邻的两个或者多个miRNA构成的miRNA群•miRNA倾向于成簇出现在染色体上；通常定义50kb的距离为一簇•同一簇中的miRNA倾向是共表达的miRNA一般特点—miRNA家族/簇序列（特别是种子序列）高度同源的miRNA被归为一个miRNA家族同一家族中的miRNA并不一定是成簇的。seedmiRNA的一般特点序列特点•非编码性•成熟的miRNA5′端为单一磷酸基团，3′端为羟基,这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；表达特点•miRNA具有时序性以及组织特异性在特定的时间，组织中才会表达保守性特点•在物种间高度保守miRNA的作用机制•通过和靶基因3′UTR（3′非翻译区）结合•导致RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,简称RISC）降解其靶mRNA或阻碍其靶的翻译。RISC转录后层面调控基因表达二、基于序列的miRNA靶基因预测方法miRNA靶基因预测遵循的基本原则miRandaTargetScanThreeClassesofmiRNATargetSites（Brenneckeetal.PlosBiology2005）（一）miRNA靶基因预测遵循的原则和基本步骤miRNA的“种子区”与mRNA的3′UTR序列碱基互补靶点在多物种间的序列保守性miRNA与mRNA形成双链结构的热力学稳定性靶基因二级结构和靶点外的序列对靶基因预测的影响遵循的原则miRNA靶位点预测的难点：•miRNA与靶位点的不完全互不配对基本步骤在3′UTR上探寻和miRNA“种子区”完全互补的序列；计算miRNA和这些序列结合产生的自由能下降值，对靶点进行筛选；对靶点进行物种间序列比对，利用物种保守性进一步筛选。（三）TargetScan•TargetScan主要考虑物种间保守的miRNA靶基因，并且在TargetScan中首次提出了“种子匹配”（seedmatch）的概念。算法的基本步骤•在TargetScan算法中，“种子匹配”被定义为miRNA5′端的第2～8位碱基与mRNA3′UTR上的一段7nt（nucleotide）序列完全互补，miRNA上的这7个核苷酸被称为miRNA“种子区”。•从种子区开始向miRNA两侧寻找互补碱基，允许G-U配对，直到出现碱基错配为止。在物种保守方面，TargetScan算法发现随着物种数目的增多,预测的靶基因数目逐渐减少,但预测结果的准确率得到提高。三、基于表达信息预测miRNA靶基因Huang等人利用在88个组织中同时检测了miRNA和mRNA表达的数据，并结合贝叶斯方法开发了靶基因预测算法GenMiR++，得到了104个人类miRNA的高精度靶基因，并通过实验证实了预测的let-7b靶基因，结果表明，与基于序列的方法相比，利用相同样本中同时检测miRNA和mRNA的表达谱可以更准确的预测miRNA靶基因。（Huang,UsingexpressionprofilingdatatoidentifyhumanmicroRNAtargets.Nat.Methods.）四、基于高通量测序结果预测miRNA靶基因ArgonauteCLIP-SeqRIP-CLIPpSILACDegradome-Seq•Agobindsinaternary三元的complextobothmiRNAandmRNA,withsufficientlyclosecontactstoallowUV-crosslinkingtoeitherRNA;mRNAtagswillbeintheimmediatevicinityofmiRNAbindingsites.ArgonauteCLIP-SeqArgonauteCLIP-SeqArgonauteCLIP-Seq,又称为HITS-CLIP（ultravioletcross-linkingandimmune-precipitationandandhigh-throughputsequencing），即紫外交联免疫共沉淀与高通量测序偶联技术。•CLIP技术是研究RNA结合蛋白（或者RNA）体内结合靶标的新技术。•通过紫外交联将RNA结合蛋白与体内结合的RNA分子进行固定，用Ago蛋白的抗体免疫共沉淀之后酶解未受蛋白保护的RNA，可以获得Ago蛋白直接结合的RNA序列。针对AGO蛋白的CLIP-seq技术能够在全基因组范围内鉴定与AGO蛋白结合的小RNA及其mRNA靶标。•Chi,SW,Zang,JB,Mele,A,Darnell,RB.2009.ArgonauteHITS-CLIPdecodesmicroRNA-mRNAinteractionmaps.Nature.460:479-86。FurthermoreHITS-CLIPreadsdonotpreciselypinpointthepositionofcrosslinkingbetweentheRNAandprotein,andthuscanonlyidentifyatargetedregion（~100-nt）asopposedtoaspecifictargetsite.2010年，GeneW.Yeo采用AGO-CLIPseq技术在线虫中鉴定了Argonaute的结合位点，发现其不仅结合mRNA的3’UTR区域，也会结合编码外显子区域，还发现Argonaute大量结合的区域对于miRNA的功能非常重要，揭示了其新的自我调控的功能。要想获得检测区域被哪个miRNA调控，还需结合预测算法五、整合已有知识预测miRNA靶基因在当前的miRNA靶基因预测研究中，研究人员逐渐意识到单一依靠序列信息或表达信息已不能继续提高miRNA靶基因预测效能。整合功能信息、蛋白质互作信息、表达信息、序列信息以及当前实验证实的miRNA靶基因等已有资源预测miRNA靶基因十分必要。miRNA靶点优化算法六、lncRNA概述及靶基因识别lncRNA定义lncRNA特点lncRNA作用机制DefinitionoflncRNALongnon-codingRNAs（longncRNAs,ln