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第四章原代细胞的培养和建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。凡是经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10-20代以上的细胞可确立为细胞系。单细胞经克隆、纯化并大量扩增所形成的特性稳定的细胞群体称为细胞株或克隆细胞。第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。一、取材的基本要求1．取材要注意新鲜和保鲜2．应严格无菌3．防止机械损伤4．去除无用组织和避免干燥5．注意组织类型、分化程度、年龄等6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。血液细胞的取材血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。动物组织取材1、鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。2、幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤（1）取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，暗处灯检，选取血管丰富、胚体有运动的胚蛋，用有色笔划出气室和胚体位置；（2）清洗蛋壳，再用碘酒、75%酒精消毒；（3）在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；（4）用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚；（5）用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。第二节原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。一、悬浮细胞的分离方法组织材料若是来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。二、实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。（一）机械分散法方法:特点:简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。（二）消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶胰蛋白酶（trypsin）分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。影响胰蛋白酶作用的主要因素细胞类型酶的活力，活力通常在1：200、56°C、pH=8.0左右时最强酶的浓度温度pH无机盐离子，钙、镁等有抑制作用消化时间胶原酶（collagenase）消化法胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。消化分离法的操作步骤：消化分离法的操作步骤剪切加液漂洗消化弃去消化液漂洗机械分散消化分离法的注意事项（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。（2）胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。三、原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞最接近和最能反映体内生长特性，适用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。（一）组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。（二）消化培养法（三）悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。（四）器官培养器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。第三节原代和传代细胞的培养和维持原代细胞的培养与维持原代细胞培养的首次传代传代细胞的传代培养传代细胞的建系和维持一、原代细胞的培养与维持（一）原代细胞培养：1．静置贴壁细胞（包括半贴壁细胞的培养）培养2．悬浮细胞的培养静置贴壁细胞（包括半贴壁细胞）培养要求细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性。细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L。培养基可用Eagle（MEM）或DMEM。小牛血清浓度为10%-20%。应在37℃、5%CO2的培养箱中培养。在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落、漂浮。待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液。骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，应将细胞悬液经低速离心后换液。悬浮细胞的培养要求原代培养时要尽量去除红细胞。短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行。细胞浓度可在5-8×109/L范围内。进行分瓶试验。长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长。细胞换液一般每隔3天需半量换液一次。细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。（二）原代细胞的维持贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液。悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法。二、原代细胞培养的首次传代原代培养后，由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度，或贴壁细胞相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养称为传一代。首次传代应注意以下几点：（1）细胞生长密度不高时，不要急于传代。（2）原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。（3）吹打已消化的细胞应减少机械损伤。（4）首次传代时细胞接种数量要多一些。（5）首次传代培养的pH应偏低些，小牛血清浓度可加大至15%～20%左右。三、传代细胞的传代培养传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。四、传代细胞的建系和维持细胞系的维持通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现。每一个细胞系都有其自身的特点，要做好建系和维持，必须记录好细胞档案，及时换液传代并做好细胞系（或株）的鉴定和管理工作。第四节原代细胞的纯化和克隆体外培养的细胞绝大多数呈混合生长，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步。一、细胞的纯化细胞的纯化分为：（一）自然纯化：长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的，如肿瘤突变细胞可通过此方法建立细胞系。（二）人工纯化：利用人为手段造成对某一种细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。主要有以下5种方法：1．细胞因子依赖纯化法：通过加入某些特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞系。2．酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。另外对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。3．机械刮除法原代培养时，如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上，可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。4．反复贴壁法成纤维细胞贴壁过程快，能在短时间内完成附着过程，而上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。5．电烙筛选法贴壁细胞转化时，在培养瓶的细胞层中会出现分散的转化灶，细胞密集、排列规则，有明显生长趋势，与周边未能转化的细胞有明显的区域界限，可用机械刮除法去除或用电烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。二、细胞的克隆化细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。主要的克隆方法有5种（一）毛细管克隆法（二）有限稀释克隆法（三）平皿克隆分离法（四）软琼脂克隆分离法（五）单细胞显微克隆法有限稀释克隆法：（1）取对数生长期的细胞制成悬液（贴壁细胞消化后吹打分散制成），计数，细胞存活率应高于90%。（2）将细胞悬液在试管中用培养基稀释至50个细胞/mL、10个细胞/mL、5个细胞/mL，将3种稀释度的细胞分别接种于96孔板中培养，每孔为0.1mL。（3）次日在倒置显微镜下观察培养板中的细胞，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加0.1mL培养液继续培养。（4）培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养液，一周左右，孔中有明显克隆出现。（5）待克隆长至孔底面的1/3～1/2时，可用消化法将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。