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超高分辨率显微镜学习报告地空学院赵思源20141000215摘要：超高分辨率显微镜是近年来生命科学领域重要的研究手段之一。2014年诺贝尔化学奖颁发给超高分辨率显微技术领域的三位科学家，以表彰他们在该领域所作出的杰出贡献。超高分辨率技术的典型代表有受激损耗、结构光照明以及单分子定位等。这些技术的出现使得传统光学显微镜难以分辨的细胞器、分子等细节信息可以被观察到，帮助科学家从纳米尺度认识细胞内分子结构、定位以及相互作用。关键词：光学衍射极限超分辨荧光成像受激发射损耗随机显微重构单分子成像Abstract:Super-resolutionmicroscopyisoneoftheadvancedmeansforthestudyoflifesciences.The2014NobelprizeinChemistrywasawardedtothreescientistsfortheircontributionstothesuper-resolutionmicroscopy.Representativetechniquesachievingsuper-resolutionarestimulated-emission,structured-illumination,andsinglemoleculelocalization.Theadvancementofthesetechniquesenablethevisualizationofthedetailincellorganelle,macromolecules,andthelocalizationofmolecules.Suchkindofinformationwasunresolvableundertraditionalopticalmicroscopesandwillhelpunderstandthestructure,location,interactionofmoleculeswithincellsinnanometerscale.Keywords:Opticaldiffractionlimit;Super-resolutionfluorescenceimaging;Stimulatedemissiondepletion(STED);Stochasticreconstructionmicroscopy;Singlemoleculeimaging1光学显微成像的衍射极限生物医学成像技术是基础生物学研究和临床医学最重要的工具之一。回顾历史，已有多位科学家凭借在成像技术方面的突破获得诺贝尔奖。其中，Ｒoentgen因发现X射线获得1901年诺贝尔物理学奖;Zernike因发明相衬显微镜获得1953年诺贝尔物理学奖;Ｒuska的电子显微镜以及Binning和Rohrer的扫描隧道显微镜获得1986年诺贝尔物理学奖;Lauterbur和Mansfield因发明核磁共振成像技术共同获得2003年诺贝尔生理医学奖。在刚刚过去的2014年，诺贝尔奖评审委员会再一次肯定成像技术的重要性，将诺贝尔化学奖授予发展超分辨率荧光显微成像技术的3位科学家。他们分别是来自美国霍华德·休斯医学研究所的EricBetzig、德国马普生物物理化学所的StefanW．Hell和美国斯坦福大学的WilliamE．Moerner(图1)。图1获得2014年诺贝尔化学奖的3位科学家光学显微成像的起源大约可以追溯到16世纪末荷兰眼镜商Janssen和他的儿子发明的原始光学显微镜。他们把两个凸透镜安装在一个筒中，发现这种组合可以放大物体。在之后的几十年中，荷兰人AnthonyVonLeeuwenhoek和英国人RobertHooke在成像原理和实践中不断改进，实现了现代光学显微镜的雏形。Leeuwenhoek第一次观察到了牙缝中的细菌;而Hooke则于1665年在显微镜下看到了软木塞的微小结构并将其命名为细胞(cell)，成为生物学研究的一个里程碑。在接下来的300多年里，各种基于光学显微的生物成像技术不断涌现，生物学家也因此取得了一个接一个重大发现。虽然光学显微镜如此有用，但生物学家一直不满意其分辨率。特别是细胞生物学家在观察细胞内部结构时图像模糊，无法看清楚细节。在实际操作中，有多种因素会影响光学成像的清晰度，包括样品自身的背景光以及对光的吸收、散射和折射等光与物质的相互作用过程，也包括物镜的色差、球差、透光度和成像元件的灵敏度等硬件因素。在这些因素之外，光学成像的分辨率的理论极限则是由光的衍射决定的。早在1835年，英国科学家GeorgeB．Airy就提出了“爱里斑(Airydisk)”的概念(图2):由于光的衍射，即使一个无限小的发光点在通过透镜成像时都会形成一个弥散的图案，即爱里斑，而其在像平面处的光强分布函数称为这个光学系统的点扩散函数(pointspreadfunction，PSF)。图2GeorgeB．Airy和他提出的爱里斑1873年，德国著名科学家ErnstAbbe揭示了由于光学成像有限孔径下光的衍射效应产生的Airydisk与成像分辨率之间的关系，即著名的阿贝光学衍射极限理论(Abbe'sdiffractionlimit)。d=(1)式中d是分辨率，λ是光的波长，n是介质的折射率，θ是聚焦光锥的半角。nsinθ又称为数值孔径(numericalaperture，NA)。基于这个公式可以看出，对于可见光波段(波长400～700nm)以水为介质的成像，由于水的折射率为1.33，而sinθ最大值是1，则其分辨率极限约为150nm。当然，θ角无法达到90度，而实际上水镜的数值孔径(NA)一般在1左右。所以通常可以定义成像分辨率约为光的波长的一半，即当两个点光源相距200nm以内时，它们的Airydisk会有很大的重叠而无法区分;同时这个公式也限定了光束聚焦形成光斑的最小尺寸约为光波长的一半。阿贝光学衍射极限理论给了我们基本的物理极限，意义重大，因此Abbe的这个经典公式也成为了他墓碑上的全部内容(图3)。图3ErnstAbbe揭示了光学成像中著名的阿贝光学衍射极限理论(Abbe'sdiffractionlimit)，其经典公式成为他墓碑上的全部内容关于阿贝光学衍射极限还有两点值得一提。一是该衍射极限对分辨率的限制也适用于其他基于物质波成像的技术，从X射线到超声成像。像X射线和电子显微镜的成像波长远远小于可见光的波长，因此有非常高的空间分辨率。但可惜这两个技术目前在活体成像方面还有很多困难，另外也不容易像荧光显微镜一样对目的分子实现特异成像和观察。另外一点是这个200nm的分辨率极限正好对生物学研究有很大的制约。首先，很多亚细胞结构和细胞器的尺度都是几百纳米到几微米，而最常用的模式生物之一大肠杆菌也就是2微米长、0.5微米粗。在这些情况下，200nm的分辨率极限制约了我们对于细节的观察。另外，细胞本身是高度拥挤的，即使目的分子的细胞内浓度只有1μmol/L，在光学衍射极限的200nm见方的立方体中也有5个目的分子，而衍射极限的存在却使我们无从知道这个体积内的具体分子数目，也无法区分它们。因此，生物学研究迫切地需要“突破”衍射极限的超高分辨率显微成像技术。2“突破”光学显微成像的衍射极限实际上，衍射极限是一种远场(far-field)效应，在近场(near-field)条件下无效。因此早期的一些尝试突破光学衍射极限的努力都是基于近场光学成像的。像这次诺贝尔奖得主EricBetzig就早在1993年发展了扫描近场光学显微镜，首次实现了室温下的单分子超分辨率成像。然而，近场光学显微镜无法用于细胞内部的成像，因此在生物领域的应用一直没有发展起来。后期的各种“突破”光学衍射极限的努力都是在远场条件下发展起来的。超高分辨率显微成像一般指在远场条件下基于荧光的、“突破”衍射极限的光学显微成像技术。荧光是物质吸收光照后发出的一类光。物质分子中的电子分布在不同的能级上。当一束光打到分子，分子具有一定的概率吸收光子，同时其处在基态的电子会跃迁到更高能量的激发态能级。处在激发态的电子有多种途径回到基态，其中一条途径就是发出一个光子(荧光)，释放能量回到基态。发射光子的能量小于被吸收的光子，因此荧光的波长比激发光的波长要长。荧光显微镜利用了荧光发射光波长比吸收光波长较长这一重要原理，通过光路设计，分开激发光和发射光，大幅降低了成像的背景。结合灵敏的检测器件，在优化条件下，荧光显微镜还可以检测单个荧光分子发出的极其微弱的荧光，成为单分子成像的最佳选择，其发展也奠定了这次诺贝尔化学奖的半壁江山。除了低背景和高灵敏度，荧光显微镜还通过对特定分子进行标记，具备很高的特异性。这一系列特点使得荧光显微镜成为生物学研究中最常用的一种光学显微镜。超高分辨率荧光显微技术通过应用一系列物理原理、化学机制和算法“突破”了光学衍射极限，把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，使我们能以前所未有的视角观察生物微观世界。目前的超高分辨率荧光显微技术大体可分为两类，一类通过调制照明光斑缩小系统的点扩散函数来实现超分辨成像，主要贡献者包括这次诺贝尔奖得主StefanHell以及MatsGustafsson;另一类则是基于单分子定位的超分辨技术，主要贡献者包括这次诺贝尔奖得主EricBetzig、W．E．Moerner以及哈佛大学庄小威教授和SamuelHess。2．1基于点扩散函数调制的超分辨技术此次获奖的德国科学家StefanHell现为德国哥廷根大学教授和德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所所长。他在1994年还在做博士后的时候就最先提出了受激发射损耗的方法(stimulatedemissiondepletion，简称STED)来打破光学衍射极限。其原理非常朴素但却十分巧妙。前面提到由于衍射极限的存在，光束聚焦的光斑尺寸不能无穷小，而是限定为光的波长的一半，这对应了荧光显微镜中聚焦激光光斑的点扩散函数。理论上，如果能缩小激光光斑就可以实现超分辨成像。Hell的基本想法是在激发光斑点扩散函数周围套上一个环形点扩散函数，以“擦除”激发光斑的外围，从而使得激发光斑“变小”(图4)。在这里，Hell利用了产生激光的受激辐射原理，用位相板产生环状的激光光斑并套在激发光斑外。这个环状光的波长匹配激发态到基态的能量差，同时功率够高，使得其区域内处在激发态的荧光分子在环状光照射下会发生整齐划一的饱和受激辐射。因为受激辐射波长与自发辐射(荧光)不同，所以环状光覆盖的受激辐射可以被挡住，而环内的自发辐射则是我们需要的荧光。由于环状光的孔径理论上可以通过增加激光强度无限缩小，这样就可以获得一个小于衍射极限的荧光激发点。这样，Hell的方法就更改了Abbe的衍射极限公式:𝑑=λ2𝑛𝑠𝑖𝑛𝜃√1+𝐼/𝑙𝐼𝑠(2)式中Is是饱和受激辐射的激光强度，I是环状光的强度。可见，随着I的增加，STED技术的分辨率可以无穷小。这个巧妙的思想在技术实现上当时是非常困难的。Hell经过多年坚韧的努力，终于在2000年实现了他在1994年提出的这个想法。他用一束激光激发荧光分子发光，再用另一束环状激光消除激发光周边的荧光，通过二维点扫描实现了超高分辨率成像，将光学显微镜分辨率提高了近10倍。然而由于荧光分子一般饱和光强较高，可达100MW/cm2，因此环状光需要极高的功率，大大加重了样品的光损伤和光漂白，制约了STED技术在生物中的应用。从2000年开始，Hell的团队不断改进STED技术，包括通过相似原理发明了基态损耗(groundstatedepletion，GSD)等一系列超高分辨率显微技术，使其更加图4德国科学家StefanHell发明的受激发射损耗的方法适用于生物研究。后期，Hell团队将STED的思想进一步延展，将这种利用饱和激发压缩激发光点扩散函数并驱动荧光分子荧光态(亮态)和非荧光态(暗态)之间的转化的方法统称为可逆饱和线性荧光跃迁(reversiblesaturableopticallinearfluorescencetransitions，简称RESOLFT)，其