4第二十章 药品的微生物学质量控制_王重振

第二十章-药品的微生物学质量控制王重振副教授[e-mail]基础医学院微生物学教研室学习要求掌握一般灭菌制剂的无菌检查方法、非灭菌药物的微生物总数测定方法熟悉药品的控制菌检查方法、药品生产中防止微生物污染的主要措施了解药品中微生物的来源和微生物引起的药物变质第一节药品生产中的微生物污染1.药品中微生物的来源①空气中的微生物（生产场所）②水中的微生物（液体制剂）③人体中的微生物（操作人员）④土壤中的微生物（植物药材）⑤原料和包装物⑥厂房建筑和制药设备2.微生物引起的药物变质存在于药物中的微生物如遇到适宜的条件就能生长繁殖，使药物发生变化，造成药物变质失效（1）外在表现（味道、气味、色素、沉淀、产气等）（2）判断（外在表现、微生物及其代谢产物检查）（3）药物变质的结果①引起感染②药物失效③微生物有毒代谢产物致病第二节药品生产中防止微生物污染的措施1.加强药品生产管理国家实施GMP管理规范，对厂房与设施、设备、物料与产品等有严格要求2.药品生产的GMP验证灭菌工艺的验证3.使用合格的防腐剂4.进行微生物学检验5.药物非临床研究质量管理规范药物非临床安全性评价研究机构动物、植物、微生物以及器官、组织、细胞、基因等第三节药品的微生物学检查一、无菌制剂的无菌检查各种注射剂、输液、手术眼科制剂都必须保证无菌，符合药典相关规定无菌检查必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染1.薄膜过滤法（首选）直径：50mm孔径：小于0.45μm薄膜过滤法的验证供试品过滤↓冲洗液过滤↓100cfu试验菌过滤↓滤膜接种于培养基验证滤膜可截留试验菌，并且试验菌生长不受供试品被截留物的抑制对照1：试验菌直接接种培养基若供试品有抑菌作用增加冲洗量使用中和剂或灭活剂如β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸（影响磺胺类抗生素）更换滤膜品种供试品的无菌检查（薄膜过滤法）供试品过滤↓冲洗液过滤↓滤膜接种于培养基↓若出现隐约浑浊可染色镜检，或转种新鲜培养基，或接种斜面培养基阳性对照：阳性对照菌与滤膜共同接种培养基阴性对照：溶剂和稀释液代替供试品2.直接接种法验证试验菌↓培养基↓加入供试品验证试验菌生长不受供试品抑制对照：不添加供试品若供试品有抑菌作用增加培养基的用量使用中和剂或灭活剂如β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸（影响磺胺类抗生素）供试品的无菌检查（直接接种法）供试品↓培养基↓若出现隐约浑浊可染色镜检，或转种新鲜培养基，或接种斜面培养基阳性对照：阳性对照菌与供试品共同接种培养基阴性对照：溶剂和稀释液代替供试品二、非灭菌制剂的微生物限度检查（一）细菌、霉菌及酵母菌计数1.平皿法平皿法的验证分组①试验组：最低稀释级供试品+100cfu试验菌②菌液组：100cfu试验菌③供试品对照组：最低稀释级供试品④稀释剂对照组：稀释剂+100cfu试验菌培养基结果判断稀释剂对照组÷菌液组×100%≥70%（试验组－供试品对照组）÷菌液组×100%≥70%若供试品有抑菌作用供试品溶液性状允许的情况下，尽量选用薄膜过滤法中和法培养基稀释法：每1ml的供试品可等量分注多个平皿离心沉淀法：500转/分钟，离心3分钟，取上清检查供试品的微生物总数测定（平皿法）不同稀释级供试品↓培养基阴性对照：溶剂和稀释液代替供试品2.薄膜过滤法薄膜过滤法的验证分组①试验组：最低稀释级供试品+100cfu试验菌②菌液组：100cfu试验菌③供试品对照组：最低稀释级供试品④稀释剂对照组：稀释剂+100cfu试验菌流程供试品过滤，冲洗，试验菌过滤，接种培养基结果判断稀释剂对照组÷菌液组×100%≥70%（试验组－供试品对照组）÷菌液组×100%≥70%若供试品有抑菌作用中和法离心沉淀法：500转/分钟，离心3分钟，取上清检查供试品的微生物总数测定（薄膜过滤法）不同稀释级供试品过滤↓冲洗液过滤↓滤膜接种于培养基阴性对照：溶剂和稀释液代替供试品（二）控制菌检查（非灭菌制剂）（1）大肠埃希菌分组①验证组：供试液+100cfu试验菌株②阳性对照：100cfu试验菌株③阴性对照：稀释液④检查组：供试液增菌培养基：胆盐乳糖培养基鉴定①MUG试验（+）和靛基质试验（+）②单阳性则接种曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂，观察菌落③分离、纯化、镜检、其他鉴定试验若供试品有抑菌作用薄膜过滤法中和法培养基稀释法离心沉淀法（2）大肠菌群（埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属）分组①验证组：供试液+100cfu试验菌株②阳性对照：100cfu试验菌株③阴性对照：稀释液④检查组：供试液（0.1ml、0.01ml、0.001ml）接种乳糖胆盐发酵管（产酸产气）接种曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂菌落特征相符且为革兰阴性无芽孢杆菌，接种乳糖发酵管（产酸产气）可能的大肠菌群数表各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数N（个/g或ml）0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml＋＋＋＞103＋＋－102＜N＜103＋－－10＜N＜102－－－＜10（3）沙门菌（4）铜绿假单胞菌（5）金黄色葡萄球菌（6）梭菌（7）白假丝酵母菌增菌培养基、鉴别方法各异（三）活螨的检查一旦检出即判供试品不合格（四）微生物限度标准（总数、控制菌）无菌制剂口服制剂：不得检出大肠埃希菌含动物脏器：不得检出沙门菌局部给药制剂：均不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌鼻及呼吸道给药制剂：不得检出大肠埃希菌阴道、尿道给药制剂：不得检出梭菌和白念珠菌谢谢！无菌检查试验菌株①大肠埃希菌-CMCC（B）44102②金黄色葡萄球菌-CMCC（B）26003③枯草芽孢杆菌-CMCC（B）63501④生孢梭菌-CMCC（B）64941⑤白念珠菌-CMCC（F）98001⑥黑曲霉-CMCC（F）98003无菌检查培养基①硫乙醇酸盐流体培养基：培养需氧菌、厌氧菌②改良马丁培养基：培养真菌③对于非水溶性供试品，可在培养基中加入表面活性剂如聚山梨酯80斜面培养基无菌检查阳性对照菌无抗菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品：金黄色葡萄球菌抗革兰阴性菌为主的供试品：大肠埃希菌抗厌氧菌的供试品：生孢梭菌抗真菌的供试品：白念珠菌微生物总数测定试验菌株①大肠埃希菌-CMCC（B）44102②金黄色葡萄球菌-CMCC（B）26003③枯草芽孢杆菌-CMCC（B）63501④白念珠菌-CMCC（F）98001⑤黑曲霉-CMCC（F）98003微生物总数测定培养基①营养琼脂培养基：细菌②玫瑰红钠琼脂培养基：霉菌及酵母菌③酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：酵母菌稀释铺板常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛亚硫酸氢钠酚类、乙醇、吸附物稀释法醛类稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯汞类制剂亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐双胍类化合物卵磷脂碘酒、洗必泰类聚山梨酯卤化物硫代硫酸盐乙二胺四乙酸（EDTA)镁或钙离子磺胺类对氨基苯甲酸β-内酰胺类抗生素β-内酰胺酶MUG试验大肠埃希菌能合成β-葡糖苷酸酶，水解4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG），生成4-甲基伞形酮4-甲基伞形酮在366nm紫外光照射下发出蓝色荧光靛基质试验大肠埃希菌能合成色氨酸酶，分解色氨酸，生成吲哚（靛基质）若加入“对二甲基氨基苯甲醛”，其与吲哚结合，可形成玫瑰吲哚曙红亚甲蓝琼脂麦康凯琼脂乳糖胆盐发酵管