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一、组织抽提：1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2.移入玻璃匀浆器加入1mlTrizol抽打匀浆3.移入1.5ml新离心管用5ml针头抽打4.冰上5分钟5.离心12,000g4℃5分钟取上清液移入1.5ml新离心管6.加0.2ml氯仿，震荡，冰上5分钟7.离心12,000g4℃10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管8.加0.5ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9.离心12,000g4℃5分钟弃去上清液10.加入1ml75%乙醇，震荡11.离心7,500g4℃5分钟弃去上清液12.室温下使之变透明13.加入DEPC处理水10μl--35μl溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：约20分钟RNA抽提物5μlRadome引物2μlRNAsin0.5μl1.65℃15分钟2.立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时RNAsin0.5μl10mMdNTP1μl5×RT缓冲液4μl25mMMgCl24μlAMV逆转录酶3μl1.37℃1.5小时2.94℃5-10分钟3.反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4.5小时25mMMgCl22μl10×PCR缓冲液5μl10mMdNTP1μl上下游引物10pmol/μl2.5μl×2CDNA模板2.5μlddH2O34μlTaq酶0.5μl轻质石蜡油50μl100μl1.94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环2.94℃45秒，55℃40秒，72℃1分钟为第二步30个循环3.72℃10分钟4.取出后4℃5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时25mMMgCl23μl10×PCR缓冲液5μl10mMdNTP1μl上下游引物10pmol/μl2.5μl×2CDNA模板5μlddH2O30μlTaq酶1μl轻质石蜡油50μl100μl1.94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环2.94℃45秒，50℃40秒，72℃1分钟为第二步40个循环3.72℃10分钟4.取出后4℃5分钟后-20℃保存或走电泳四、电泳：约1.25小时1.配0.5×TBE电泳缓冲液300ml2.胶浓度1.7%（40ml0.5×TBE加0.68g胶）3.微波炉中火2分钟溶解胶4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）5.放入梳子，浇板，待凝固6.加8μlPCR反应产物+2μl溴酚兰7.电泳50-80V（每㎝5V）一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris54g硼酸27.5g0.5MEDTA20ml？pH8.0蒸溜水1000ml5×TBE（贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液450ml水--→500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液，4℃保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。2、1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g六、需购置的Rt-PCR材料：（生工.Tel.2236106.）Taq酶（含MgCl2Buffer）200u70.00dNTP:1支oligo(dT)15:1OD40.00promegaM-MLV:1支250.00promega(Buffer)RNasin:1支110---20℃DEPC5g110.00Trizol100ml/1瓶InvitrogenLifetechnologies--4℃Marker:10μg0.2μg/ml150.00科威（1543.994.697.515.377.231）七、引物合成正义：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′反义：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′2、par-4:正义：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′反义：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′3、退火温度计算2（AT）4（GC）正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）4、引物各合成5OD，每OD一瓶分装好5、引物稀释：加DEPC水量为（μl）=?nmol/OD×管上所标OD数×100是为10pmol/μl浓度的引物溶液八、PCR产物电泳先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。九、几个注意点：1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。3、RNA抽提前，打开离心机预冷。TRIzol法抽提总RNA细胞1×107组织100mg↓加1mlTRIzol细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块↓匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管）↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓4℃，离心12000g，15分钟↓转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中↓加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟↓4℃，离心12000g，10分钟↓弃上清↓加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml↓4℃离心7500g，5分钟↓弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）↓溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）（可在55-60℃水中，10分钟助溶）注：1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年两步法RT-PCR（第一步：逆转录反应）试剂浓度体积终浓度RNA23μl(11.5μl)Oligo(dT)150.05μg/μl4μl(2μl)0.005μg/μl（稀释10倍后用）↓混匀，离心，70℃5min↓立即冰水浴，稍离心↓试剂浓度体积终浓度M-MLVBuffer5×8μl(4μl)1×dNTP10mM2μl(1μl)0.5mMRNasin40U/μl1μl(0.5μl)20μM-MLV200U/μl2μl(1μl)200U总体积40μl（20μl）↓混匀，离心，42℃60min↓95℃10min（破坏MLV）↓4℃保存两步法RT-PCR（第二步：PCR反应）总体积20μl(50μl)试剂浓度体积终浓度TaqBuffer10×2μl(5μl_)1×MgCl225mM1.2μl(3μl)1.5mMdNTP10mM0.2μl(0.5μl)200uM上游引物10pmol/μl0.3μl(1μl)10pmol下游引物10pmol/μl0.3μl(1μl)10pmolcDNA模板X(?)(1-10μl)DEPC水20μl-4.3μl-XTaq酶2.5U/μl0.3μl(1μl)2.5U/μl↓混匀↓97℃，5分钟↓立即冰水浴↓混匀↓95℃5分预变性94℃30秒变性X℃40秒退火72℃30秒延伸72℃7分终末延伸28-36循环，4℃保温三、电泳：加1-10μlPCR产物溴芬兰（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融。取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2.震荡30s。3.加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4.12000×g，4℃离心，15min。5.吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6.加等体积异丙醇，-20℃，30min。7.12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀8.弃上清，加75％乙醇1ml，振荡。9.7500×g，4℃离心，10min。10.弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5－10min。11.沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD28012.计算浓度与纯度，－70℃保存。OD260×40×稀释倍数RNA浓度（μg/μl）＝────────────1000逆转录合成cDNA反应体系如下━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━MgCl22μl10×RTBuffer1μlRNaseFreedH2O3.75μldNTPMixture(各10mM)1μlRNaseInhibitor0.25μlAMVReverseTranscriptase0.5μlRandom9mers0.5μlPositiveControlRNA(1μg)1μl混匀快速离心一次反应条件如下30℃10min42℃30min99℃5min5℃5min-20℃冰箱冻存PCR反应━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━摸板cDNA2.5μl5×PCRBuffer2.5μl灭菌蒸馏水7.2μl聚合酶ExTaqHS0.1μl上游引物0.1μl下游引物0.1μl─────────────────────────────Total12.5μl混匀快速离心一次反应条件94℃2min1Cycle94℃40sec┓50-65℃40sec┃25-35Cycles72℃1min┛72℃5min1CyclePCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl加5×LoadingBuffer2μl2%琼脂糖凝胶电泳120V100mA30min溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果