分子生物学实验一植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测高级分子生物学实验课一实验要求•分组实验•仔细观察、认真操作•不大声喧哗•不迟到早退•有事向课代表请假•按时交实验报告DNA结构ATGCDNA存在形式与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来–细胞破碎•研磨–膜、组蛋白的分离•CTAB•SDS–DNA纯化•蛋白变性•去除酚、糖–DNA的沉淀•乙醇•异丙醇植物DNA提取流程细胞破碎①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。DNA提取SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB法CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。该复合物在高盐的溶液中（0.7mol/LNaCl）可溶。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇（PVP）是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除CTAB抽提液作用原理DNA纯化（去杂质）蛋白质常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA常选用RNase消化，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖提取液中加1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。实验材料杨树叶片试剂2×CTAB抽提液氯仿：异戊醇(24:1)异丙醇70%乙醇材料与试剂①微量移液器②水浴锅③离心机④电泳仪及电泳槽⑤凝胶成像仪仪器用具常见问题常见问题DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。电泳原理•琼脂糖是一种线性多糖聚合物。•浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2Tris-乙酸（TAE）Tris-硼酸（TBE）Tris-磷酸（TPE）常用电泳缓冲液维持合适的pH具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移保护DNA不被降解电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液核酸染色剂溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。其它染料：GeneFinder、Goldview、Genegreen等–DNA分子量标准染色、照相•溴化乙啶（EB）•UVLight•CCD•实验报告–目的、材料与方法、结果、讨论作业