21药物的现代分析方法

第二十一章药品质量控制中现代分析方法的进展药物分析中最常用的分析方法是•色谱分析法•光谱分析法•色谱－光谱分析法联用技术其中•色谱分析法主要应用毛细管GC、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法•光谱分析法主要应用四大波谱•毛细管电泳及其应用•超高效液相色谱及其应用•手性HPLC技术与应用•GC-MS技术与应用•LC-MS技术与应用•液相色谱-核磁共振联用技术本章主要内容（一）简介以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术电泳是电解质中带电粒子在电场作用下向电荷相反方向迁移的现象，利用这种现象对物质进行分离分析的方法，称之为电泳法在散热率很高的毛细管内进行的电泳分析，称为毛细管电泳法第一节毛细管电泳及其应用主要特点•高效：n高达数十万块/米，甚至数百万块•高速：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质•微量：仅需nL（10-9L）级的进样量•仪器简单，低消耗：分析一个试样仅需几毫升流动液•采用空心毛细管，不易产生柱污染•检出灵敏度和精密度均不及HPLC（二）基本装置与原理•电压：0～30KV•分离柱不涂敷任何固定液•紫外或激光诱导荧光检测器（可检测：10-19～10-21mol/L）1基本装置2基本原理带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反的电场方向迁移的现象，称为电泳，速度vep单位电场下的电泳速度称电泳淌度Evepep电泳及电泳淌度显然，淌度是粒子在单位电场强度、单位时间内移动的距离6qep∴对于给定的介质和离子，淌度是该离子的特征常数对于球形离子，淌度与该离子的半径r、电荷q及溶液粘度η有关由于玻璃表面存在硅羟基，pH3时,形成双电层，在高电场的作用下水合阳离子带动整体溶液向负极移动的现象称为电渗，速度veo单位电场下的电渗速度称电渗淌度Eveoeo因电渗现象引起的液体流动叫电渗流电渗及电渗流带电粒子的迁移速度vap＝电泳和电渗流两种速度的矢量和石英毛细管：带负电荷。电渗流流向阴极，通常veo约为vep的5－7倍epeoap阳离子epeoap阴离子eoap中性粒子Evvveoepeoepap)(正离子：两种效应的运动方向一致，最先流出中性粒子:无电泳现象，只受电渗流影响，在阳离子后流出（不被分离）阴离子：两种效应的运动方向相反,最后流出除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样被相互分离HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）液相色谱中的液流为抛物线流型，管中心处的速度为平均速度的2倍（谱带展宽较大）（三）主要分离模式最基本、应用最广的分离模式1毛细管区带电泳CZE2胶束电动毛细管色谱MECC在缓冲溶液中加入超过临界浓度的表面活性剂，形成荷电胶束，在电场力的作用下，胶束在柱中移动系色谱与电泳分离模式的结合，中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长用于分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳法的应用范围凝胶具有多孔性，类似分子筛的作用，使试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，用CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。3毛细管凝胶电泳CGE特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在电场力的作用下迁移，分别到达其等电点pH位置时，呈电中性，停止移动，由此可使它们得到分离可分离等电点差异小于0.01pH单位的两种蛋白质根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术4毛细管等电聚焦CIEF5毛细管电色谱CEC在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程•毛细管等速电泳（CITP）•微芯片毛细管电泳（microchipelectrophoresis）（四）高效毛细管电泳应用与进展一、离子分析（CZE/MECC）二、药物及代谢产物、生物材料分析三、手性化合物分析四、氨基酸分析五、肽、蛋白质、核酸分析及DNA测序六、单细胞、单分子监测采用MEKC模式，鉴定违禁药物；Clicktoaddtitleinhere自20世纪70年代以来，随着高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)技术的不断发展，美国Waters公司于2004年的匹兹堡会议上推出了最新研制的ACQUITY超高效液相色谱(UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC)，其采用1．7Ixm细粒径的新型固定相，可获得高达2万块／m理论塔板数的超高柱效，并以系统整体设计的创新技术，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度，造就了液相色谱性能上的飞跃和进步并形成分离科学的一个新兴领域。第二节超高效液相色谱超高效液相色谱（UPLC）的原理UPLC的理论基础为：范德米特(VanDeemeter)方程HETP=A(dP)+B／v+Cu(dP)2HETP：理论塔板高度A：涡流扩散系数由该方程可得出结论：颗粒度越小柱效越高；每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方向移动，而且有更宽的线速度范围所以降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。dP：填料粒径B：分子径向扩散系数C：传质因子为流动相线速度vanDeemter曲线的提示如果填料的颗粒继续演变……未来的色谱:更小的颗粒度液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。小颗粒分离的理论与科学基础更小颗粒度所面临的挑战Clicktoaddtitleinhere小颗粒带来生产力--------UPLC的优点超高分离度UPLC与HPLC：分离度比较由下图可见：UPLC可以大大提高分离度，同时色谱峰强度也得到了提高。小颗粒带来生产力--------UPLC的优点超高速度图4:UPLC与HPLC：速度比较图5：UPLC美国药典有关物质分析实例原有HPLC分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱，至少需要65分钟才能完成；UPLC使用了一根色谱柱、一种简单方法，在1分钟内即可完成。小颗粒带来生产力--------UPLC的优点超高灵敏度速度图6:HPLC到UPLCTM：灵敏度的改善无需折衷UPLC使用小颗粒技术可以得到更高的柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽，即更高的灵敏度。与UPLC匹配的色谱柱比较少峰面积的重复性欠佳对高频检测仪器的需要超高效液相色谱的局限性尽管UPLC能显著减少复杂样品的分析分离时间，提高检测的灵敏度和分离度，但目前UPLC的使用仍然存在局限性，其普及应用可能仍然需要一些时间。色谱柱要能够耐受由于粒径减小而带来的高反压，而且粒径的减小也给色谱柱充填技术带来了挑战。UPLC分析样品时峰面积的重复性略逊于HPLC，特别是低浓度样品时更加明显，其峰面积重复性的RSD约为HPLC的2倍。UPLC分离样品色谱峰扩展很小，通常峰底宽度只有几秒钟，低浓度的样品峰则更窄。使用UPLC测定低浓度样品时，准确度、精密度都比较差。第三节手性HPLC技术与应用（一）概述•手性药物现状天然或半合成药物光学活性物98%无光学活性物2%全合成药物非手性药物60%手性药物之外消旋体36%手性药物之对映纯化合物4%1对某些手性药物进行对映体的纯度检查；2生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；3在研制手性药物过程中，可分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应以及药动学性质；4必要时，可进行手性药物对映体的制备分离（或拆分）•手性色谱分离的意义（二）手性药物拆分方法的机理引入不对称中心（或光学活性分子）把手性混合物转换成为非对映异构体，然后利用其化学或物理化学性质的差异使之分开色谱法拆分机理•三点手性识别模型DD对映体手性选择剂HPLC拆分法采用手性固定相或在流动相中加入手性添加剂，分离分析立体异构体的方法一般手性固定相与其相反构型的对映体之间作用力强，易形成瞬间非对映体“配合物”，使手性组分得到保留手性固定相系将手性官能团键合在载体上而成（三）手性HPLC拆分法分类1间接法手性衍生化试剂(CDR)法2手性流动相拆分法（直接法）CMP3手性固定相拆分法CSP柱前手性衍生化反应的注意事项•手性试剂必须是高光学纯度的试剂•衍生化反应要定量完成（90-100%）•手性待测物必须具有可反应的活性基团如-NH2、-OH、-COOH等•手性试剂及产物应稳定，且具有不同的紫外或荧光特性•生成的非对映异构体应具有较高的柱效1间接法手性衍生化试剂(CDR)法手性衍生化反应(R)-SE+(R)-SE–(R)-SA(R)-SE–(S)-SA(R)-SA(S)-SASE光学活性试剂，也称“选择剂”SA手性溶质，也称“选择靶”如醇类与手性酸或酰氯酯化可使用价格便宜、柱效较高的非手性柱通过衍生化反应可提高检测灵敏度衍生化过程可同时纯化样品缺点需要高纯度的手性衍生化试剂操作复杂费时，有时需严格控制反应时间和温度优点在流动相中加入手性添加剂，使其与待测物形成对映异构体复合物，依据复合物的稳定常数不同以及药物与结合物在固定相上分配的差异而得到分离2手性流动相拆分法（直接法）CMP常用手性添加剂配基交换型手性添加剂（CLEC）用于分离氨基酸及其衍生物、多巴胺环糊精(CD)类添加剂常用-CD，－CD、改性CD手性离子对络合剂常用(+)-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁利用手性固定相与对映体消旋物相互作用，生成不稳定的短暂的对映体复合物，使两种异构体在色谱柱上的保留时间不同，从而得到分离3手性固定相拆分法CSP常用的手性固定相Pirkle型手性固定相-碱型手性固定相、-酸型手性固定相和氨基酸类手性固定相蛋白质类手性固定相环糊精键合相手性聚合物固定相CSP特点1.适用范围广2.制备分离方便3.定量分析的可靠性高4.价格昂贵（四）CDR、CMP和CSP的比较优点缺点应用条件简易，固定相和移动相同普通HPLC，并有利于增加检测灵敏度样品须预分离，对衍生化手性试剂的光学纯度要求高，异构体对的衍生化速率不一CDR不必作柱前样品衍生化，对固定相也无特殊要求，样品的非对映异构化络合的可逆性有利于制备可拆分的化合物范围有限，某些添加剂欠稳定且往往干扰检测CMP适用于各类化合物,无需高纯试剂,适于常规及生物样品的分析测定,制备分离便利,定量分析可靠性较高样品有时亦须作柱前衍生(但未必用手性试剂)，对样品的结构仍有一定限制，CSP柱昂贵，而适用性差CSP拆分实例酰胺型手性固定相直接拆分克仑特罗对映体色谱柱：Chirex3005手性色谱柱（（R）-1-萘基甘氨酸和3,5-二硝基苯甲酸共价键合）流动相：正己烷:二氯乙烷:甲醇＝54:38:8（V/V/V）流速：1ml/min检测波长：247nm柱温：17℃（1）克仑特罗分子上的－NH与固定相萘乙基酰胺部分的－C=O形成氢键作用；（2）克仑特罗分子上的－OH与固定相3,5-二硝基苯甲酰胺的－NH形成氢键；（3）克仑特罗分子上的芳基与固定相上的3,5-二硝基苯基之间的电子授受作用力因对映体的构型不同而不同，（＋）-S构型对映体的空间位置有利于电子授受力的形成，而（－）-R构型对映体上的芳基与3,5-二硝基苯基的距离远，不易发生上述作用。所以，由于空间构型的不同，使得S构型的对映体有利于“三点相互作用”的形成，与固定相的作用力强，保留时间也长，后洗脱出